近期，聶堯教授團(tuán)隊(duì)在利用非經(jīng)典氨基酸理性提高酶蛋白的熱穩(wěn)定性方面取得重要進(jìn)展，研究成果“Computational design of noncanonical amino acid-based thioether staples at N/C-terminal domains of multi-modular pullulanase for thermostabilization in enzyme catalysis”正式發(fā)表于Computational and Structural Biotechnology Journal （IF=7.271） （https://doi.org/10.1016/j.csbj.2020.12.043）。

 

　　酶的熱穩(wěn)定性是酶蛋白的一個(gè)重要特性，其可用于評(píng)估酶蛋白在工業(yè)應(yīng)用的可行性，故酶蛋白的熱穩(wěn)定化被認(rèn)為是生物合成中一個(gè)關(guān)鍵且通常必須的步驟。酶蛋白熱穩(wěn)定化的常規(guī)策略通常是引入由天然氨基酸取代引起的非共價(jià)相互作用和/或天然共價(jià)鍵來穩(wěn)定酶蛋白。然而，酶蛋白尤其是多結(jié)構(gòu)域蛋白的活性與穩(wěn)定性之間的權(quán)衡仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)。

 

　　該研究拓展了一種計(jì)算機(jī)輔助策略，通過將非經(jīng)典氨基酸引入形成硫醚鍵來“裝訂”具有多結(jié)構(gòu)域的普魯蘭酶（BtPul）相對(duì)柔性的N/C端結(jié)構(gòu)域，以提高其熱穩(wěn)定性。首先利用RosettaMatch算法及自由能預(yù)測(cè)工具設(shè)計(jì)并優(yōu)化溴乙基-酪氨酸在普魯蘭酶N/C末端結(jié)構(gòu)域中的引入位點(diǎn)；其次，采用雙質(zhì)粒共表達(dá)的方式在宿主菌中引入目的基因重組質(zhì)粒的同時(shí)引入O2beY正交氨酰-tRNA合成酶/tRNA系統(tǒng)，從而使O2beY能夠翻譯至目的蛋白中；最終，通過誘導(dǎo)表達(dá)實(shí)現(xiàn)非天然硫醚鍵對(duì)普魯蘭酶N/C端結(jié)構(gòu)域的“裝訂”。多個(gè)單突變體酶學(xué)性質(zhì)的研究結(jié)果顯示，最優(yōu)突變體T73（O2beY）-171C的半衰期較野生型提高157％，Tm值提高7.0 ℃。通過進(jìn)一步引入親水性殘基增加非天然硫醚鍵周圍疏水表面上的局部親水性以實(shí)現(xiàn)酶的活性-穩(wěn)定性的平衡，組合突變體T73（O2beY）-171C/T126F/A72R在70 ℃下的半衰期提高211％，酶活增加44％。該研究通過計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)非天然共價(jià)硫醚鍵“裝訂”酶蛋白的方式擴(kuò)展了酶熱穩(wěn)定改造策略，為其它酶蛋白尤其是多結(jié)構(gòu)域酶的穩(wěn)定性改造提供了參考。

 

　　聶堯教授為論文通訊作者，生物工程學(xué)院碩士研究生畢家華為第一作者。上述研究工作得到了國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31872891）、高端外國(guó)專家項(xiàng)目（G20190010083）、江蘇省六大人才高峰項(xiàng)目（2015-NY-007）、宿遷市酶學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目（M201803）、輕工技術(shù)與工程一流學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目（LITE2018-09）等的資助。