近期，江南大學生物工程學院陳堅院士團隊劉龍教授課題組在轉錄因子工程和輔因子工程策略協(xié)同提高N-乙酰氨基葡萄糖的生產(chǎn)方面取得重要進展，研究成果“Synergistic improvement of N-acetylglucosamine production by engineering transcription factors and balancing redox cofactors”正式發(fā)表于metabolic Engineering （IF=9.783） （https://doi.org/10.1016/j.ymben.2021.07.012）。

 

　　對代謝途徑中關鍵基因的轉錄水平進行調控是代謝工程常用策略，但該策略往往不能明顯提高目標產(chǎn)物的效價，甚至導致工程菌株胞內(nèi)碳/氮代謝網(wǎng)絡和輔因子網(wǎng)絡的失衡。全局轉錄調控工程通過采用具有特定功能的轉錄因子來激活或抑制特定代謝途徑中多個基因的協(xié)同表達，從而可以有效提高目標代謝物的合成。同時，目標代謝產(chǎn)物合成途徑中普遍涉及多種輔因子，而輔因子供應不足和輔因子不平衡等問題往往成為高效生物合成的重要瓶頸。因此，為實現(xiàn)目標代謝物的高效合成，平衡工程菌株的碳/氮代謝轉錄網(wǎng)絡和氧化還原代謝網(wǎng)絡是至關重要的。

 

　　針對上述問題，該研究首先驗證了碳代謝的七種全局轉錄調控因子GlxR、RamA、RamB、SugR、LldR、FruR和GntR1對谷氨酸棒狀桿菌產(chǎn)生GlcNAc的影響。結果表明，過表達RamA的重組菌株的GlcNAc產(chǎn)量提升最為明顯，而高表達RamB、LldR和FruR的菌株的GlcNAc產(chǎn)量減少。因此，進一步構建了RamA的A結構域（轉錄調控結構域）和B結構域（DNA結合結構域）的突變體庫，并采用高通量篩選的方法從中篩選正突變體并進行組合突變。通過表達組合突變型轉錄因子RamAM，使得GlcNAc在搖瓶中的效價提高到16 g/L，進一步通過轉錄組測序及ITC實驗解析了突變菌株高產(chǎn)GlcNAc的原因。其次，研究人員在谷氨酸棒桿菌中開發(fā)了基于dCpf1的CRISPRi系統(tǒng)，還發(fā)現(xiàn)轉錄因子RamB、LldR、FruR以及AmtR對GlcNAc的產(chǎn)生具有負向調節(jié)作用，因此，研究人員將CRISPRi系統(tǒng)運用于干擾對GlcNAc合成呈現(xiàn)抑制作用的相關轉錄因子的表達，從而促進GlcNAc的效價進一步提高至27.5 g/L；之后，由于細胞內(nèi)輔因子代謝網(wǎng)絡可以通過修飾目標產(chǎn)物合成途徑中氧化還原反應相關酶的輔因子偏好性來平衡，研究人員通過數(shù)據(jù)庫搜索和蛋白質結構序列比對，對GlcNAc合成途徑中的關鍵酶甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）和蘋果酸脫氫酶（MDH）的輔因子結合口袋附近的氨基酸殘基進行了一系列突變。通過篩選發(fā)現(xiàn)突變體GAPDH N208R/F323S和MDH E47G/A51S具有有益效果，使GlcNAc在搖瓶中的效價提高到36.9 g/L；最后，為了擴大了GlcNAc的生產(chǎn)規(guī)模，研究人員將重組谷氨酸棒桿菌在50-L發(fā)酵罐中進行放大生產(chǎn)，放大生產(chǎn)所得GlcNAc效價達117.1 g/L，為對照組的6.62倍，與此同時，葡萄糖轉化至GlcNAc的轉化率也從0.19 g/g提高到0.31 g/g。該研究所開發(fā)的一系列策略有助于優(yōu)化細胞內(nèi)碳氮代謝網(wǎng)絡的全局轉錄水平以及細胞內(nèi)輔因子水平，為重構微生物代謝網(wǎng)絡和提高微生物細胞工廠的性能提供了新的方法和思路。

 

　　劉龍教授為論文通訊作者，生物工程學院2017級博士生鄧琛為第一作者。上述研究工作得到了國家自然科學基金（32021005, 31930085）、國家重點研發(fā)項目（2018YFA0900300, 2018YFA0900504）、中央高校基本科研業(yè)務費專項資金資助（JUSRP52019A）、山東省重點R&D項目（重大科技創(chuàng)新項目）（2019JZZY 011002）等項目的資助。