實(shí)現(xiàn)重要農(nóng)作物精準(zhǔn)基因組編輯對(duì)加快農(nóng)作物遺傳改良進(jìn)程具有重要意義。引導(dǎo)編輯技術(shù)（Prime editing）是一種基于CRISPR/Cas系統(tǒng)的全新精確基因組編輯技術(shù)。2020年，包括我院在內(nèi)的多家實(shí)驗(yàn)室實(shí)現(xiàn)了植物引導(dǎo)編輯技術(shù)的初步突破，但植物基因組中很多位點(diǎn)編輯效率依舊很低，亟需突破技術(shù)瓶頸，實(shí)現(xiàn)編輯效率顯著提升。

 

　　近日，北京市農(nóng)林科學(xué)院玉米DNA指紋及分子育種北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室基因組編輯團(tuán)隊(duì)與北京大學(xué)等單位合作，發(fā)現(xiàn)新策略協(xié)同效應(yīng)，在植物引導(dǎo)編輯技術(shù)研發(fā)方面取得了重大新突破，實(shí)現(xiàn)了玉米和水稻引導(dǎo)編輯效率平均可提高3倍，在多個(gè)低效靶點(diǎn)上甚至可提高10倍以上，并在人細(xì)胞中進(jìn)行了驗(yàn)證。該結(jié)果于12月23日以“A design optimized prime editor with expanded scope forbid capability in plants”為題在植物科學(xué)類國(guó)際頂級(jí)學(xué)術(shù)刊物Nature Plants（15.793）在線發(fā)表。

 

　　該團(tuán)隊(duì)在前期研究中發(fā)現(xiàn)，在ALS基因靶點(diǎn)的反轉(zhuǎn)錄（reverse tranase，RT）模板中引入2個(gè)額外的同義錯(cuò)配堿基，可使其編輯效率增加7倍。繼續(xù)使用類似策略在水稻愈傷8個(gè)靶點(diǎn)上進(jìn)一步測(cè)試，發(fā)現(xiàn)半數(shù)靶點(diǎn)在模板引入同義錯(cuò)配堿基時(shí)編輯效率明顯提高，這在人細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中也得到了驗(yàn)證；植物引導(dǎo)編輯普遍沿用Cas9切刻酶變體H840A的C端融合逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV的方式，本研究發(fā)現(xiàn)N端融合的編輯效率在植物3個(gè)I型靶點(diǎn)上明顯高于C端融合的，而在II型靶點(diǎn)和人細(xì)胞中的編輯效率均無(wú)明顯差異。穩(wěn)定轉(zhuǎn)化結(jié)果表明，在測(cè)試的8個(gè)靶點(diǎn)上，引入同義錯(cuò)配堿基和N端融合均不同程度地提高了編輯效率。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，將“引入同義錯(cuò)配堿基”與“N端融合”這兩種策略組合（PE-P3-RT-M）使用時(shí)，出現(xiàn)了倍增協(xié)同效應(yīng)。在愈傷中的5個(gè)靶點(diǎn)上增效倍數(shù)平均達(dá)到10倍以上。而在穩(wěn)定轉(zhuǎn)化材料的8個(gè)靶點(diǎn)上，編輯效率平均提升也在10倍以上，尤其在4個(gè)原來(lái)不能編輯的靶點(diǎn)上，實(shí)現(xiàn)了平均約25%的編輯效率。為進(jìn)一步確認(rèn)該組合策略的倍增協(xié)同效果，作者在水稻和玉米各選擇了另外7個(gè)基因組靶點(diǎn)進(jìn)行了測(cè)試，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在大多數(shù)靶點(diǎn)中，PE-P3-RT-M策略均表現(xiàn)出最高的協(xié)同增效。作者最后還總結(jié)了測(cè)試靶點(diǎn)的特征形式，并對(duì)植物中進(jìn)行引導(dǎo)編輯高效靶點(diǎn)設(shè)計(jì)給出了詳細(xì)建議。

　　最近，哈佛大學(xué)David Liu團(tuán)隊(duì)在Cell雜志上報(bào)道，通過(guò)瞬時(shí)表達(dá)抑制DNA錯(cuò)配修復(fù)（MMR）通路的蛋白，或在模板上引入沉默堿基，提高引導(dǎo)編輯效率2.0到7.7倍。與上述研究相比，本研究不僅首次發(fā)現(xiàn)引入同義錯(cuò)配堿基可以顯著提升植物引導(dǎo)編輯的效率，并發(fā)現(xiàn)了N端融合逆轉(zhuǎn)錄酶比C端融合更有利于植物的逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程。而將“引入同義錯(cuò)配堿基”與“N端融合”策略組合在一起時(shí)，還具有倍增協(xié)同效應(yīng)，可獲得更高的植物引導(dǎo)編輯效率。這三方面全新發(fā)現(xiàn)實(shí)現(xiàn)了基因組編輯技術(shù)的新突破，大幅提升了引導(dǎo)編輯效率，為植物基因組功能解析和作物精準(zhǔn)育種提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支撐。

 

　　徐雯、楊永星為本文共同第一作者，楊進(jìn)孝和趙久然研究員為通訊作者，北京大學(xué)張博、張傳茂教授團(tuán)隊(duì)、西南大學(xué)肖前林副教授團(tuán)隊(duì)參與了本項(xiàng)工作。本研究得到北京學(xué)者（BSP041）、院財(cái)政專項(xiàng)基金的支持。玉米基因組編輯團(tuán)隊(duì)是2017年由玉米DNA指紋及分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室引進(jìn)建設(shè)的技術(shù)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，目前團(tuán)隊(duì)主要聚焦于堿基編輯、精確替換、組學(xué)編輯及其在玉米和水稻等作物中的高效應(yīng)用。這是該團(tuán)隊(duì)自引進(jìn)以來(lái)在國(guó)際學(xué)術(shù)期刊上發(fā)表的第10篇高水平研究論文。

 

　　原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41477-021-01043-4