近日，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所作物有害生物功能基因組研究創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)在國際著名學(xué)術(shù)期刊 Genome Biology 在線發(fā)表了題為“SpRY greatly expands the genome editing scope in rice with highly flexible PAM recognition”的研究論文。本研究首次將SpCas9突變體SpG和SpRY應(yīng)用于植物，在水稻中實(shí)現(xiàn)NRN PAM和NYN PAM的靶向操作，所開發(fā)的系列工具大大擴(kuò)展了CRISPR系統(tǒng)在植物基因組中的應(yīng)用范圍。
近幾年來，基因組編輯技術(shù)發(fā)展迅速，并廣泛應(yīng)用于人類基因治療、動(dòng)植物分子育種等各領(lǐng)域。由于傳統(tǒng)的 Streptococcus pyogenes Cas9（SpCas9）和后期挖掘的各Cas蛋白為典型的G-PAM識(shí)別類型，在應(yīng)用中多少具有一定程度的局限性。研究人員一直在尋找各種新型CRISPR/Cas系統(tǒng)，以期突破對(duì)G-PAM識(shí)別特異性的限制，擴(kuò)展各基因編輯工具在生物體基因組中的靶向范圍。
本研究聚焦于SpCas9的兩個(gè)新型突變體SpG和SpRY，研究發(fā)現(xiàn)SpG對(duì)NG PAM具有偏好性，但其活性低于團(tuán)隊(duì)之前挖掘的SpCas9-NG。而SpRY在大量基因組靶位點(diǎn)上實(shí)現(xiàn)了高效編輯，對(duì)G-PAM和A-PAM均具有偏好性。基于SpRY切口酶而開發(fā)的胞嘧啶堿基編輯器rBE66通過識(shí)別NAG PAM對(duì) OsCOI2 和 BSR-K1 實(shí)現(xiàn)靶堿基定向編輯，編輯效率分別為26.00%和4.26%。將SpRY切口酶和腺苷脫氨酶TadA8e融合而開發(fā)的腺嘌呤堿基編輯器rBE62，能夠有效識(shí)別NAA、NAT和NAC PAM，對(duì) OsMPK13 、 OsGS 和 OsGSK4 編輯效率分別高達(dá)29.79%、93.75%和51.28%。此外，本研究揭示了SpRY具有高頻的自編輯事件（即對(duì)T-DNA上的sgRNA序列進(jìn)行編輯），而SpRY切口酶介導(dǎo)的堿基編輯的自編輯事件較低頻發(fā)生。這些結(jié)果表明SpRY可用于水稻基因組定點(diǎn)編輯，尤其是單堿基編輯，并擴(kuò)寬了CRISPR技術(shù)在植物基因組中編輯范圍，為后續(xù)基因組編輯衍生工具開發(fā)，以及將來植物基因功能研究材料和新種質(zhì)材料的定制提供了有力的理論指導(dǎo)和技術(shù)支撐。
中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所碩士生徐子妍（周雪平課題組）和博士生曠永潔（周煥斌課題組）及博士后任斌（合作導(dǎo)師：周煥斌研究員和王桂榮研究員）為共同第一作者，周煥斌研究員和周雪平教授為共同通訊作者，團(tuán)隊(duì)多名成員共同合作完成，中國農(nóng)業(yè)大學(xué)孫文獻(xiàn)教授和挪威生物經(jīng)濟(jì)研究所Carl Spetz也參與研究工作，本文得到了中國國家自然科學(xué)基金、中國農(nóng)科院科技創(chuàng)新工程、基地平臺(tái)提質(zhì)增效技術(shù)創(chuàng)新任務(wù)、中國國家轉(zhuǎn)基因科技計(jì)劃等項(xiàng)目支持。
論文鏈接：https://genomebiology.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13059-020-02231-9
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