超低溫保存（cryopreservation）是在液氮（-196℃）中保存細胞、組織和器官的技術(shù)，廣泛應(yīng)用于動物、植物和微生物種質(zhì)資源的長期保存。植物超低溫保存通常與離體培養(yǎng)技術(shù)（in vitro culture）相結(jié)合，可以實現(xiàn)花粉、愈傷組織、體細胞胚、合子胚、種子、離體分生組織和休眠芽的長期安全保存。重要農(nóng)作物和觀賞植物的超低溫保存技術(shù)較為成熟、全球馬鈴薯和香蕉的主要野生種和品種都實現(xiàn)了超低溫保存。

 

　　種質(zhì)庫是野生植物遷地保護（ex situ conservation）最有效和經(jīng)濟的手段。大部分野生植物的種子脫水后可以在低溫（-20℃）下長期保存，其壽命得到大幅度延長。一些植物的種子不耐受脫水而無法進行低溫保存，通常被稱作頑拗型（recalcitrant）種子。根據(jù)英國千年種子庫2018年在Nature Plants雜志發(fā)表的評論文章“Seed banking not an option for many threatened plants”，全球范圍有8%的植物產(chǎn)生頑拗型種子，但在極度瀕危（critically endangered）植物和樹種（tree species）中這一比例分別高達36%和33%。全球植物保護戰(zhàn)略（The Global Strategy for Plant Conservation）的目標7要求對75%的瀕危物種實現(xiàn)遷地保護，這一目標的實現(xiàn)需要對植物超低溫保存技術(shù)的投入和支持。

 

　　水在結(jié)晶后體積變大。細胞水分在超低溫下形成大的結(jié)晶會破壞細胞膜結(jié)構(gòu)而導(dǎo)致細胞死亡。第一代植物超低溫保存技術(shù)通過程序降溫（controlled rate cooling）誘導(dǎo)胞外結(jié)晶而對細胞緩慢脫水，胞內(nèi)液體濃度和粘稠度提升，在超低溫下進入玻璃化狀態(tài)（vitrification），避免了胞內(nèi)結(jié)晶而保證細胞存活。第一代超低溫保存技術(shù)僅適用于耐冷（cold hardy）植物。新的玻璃化超低溫技術(shù)以高濃度的植物玻璃化溶液（plant vitrification solution）處理細胞，在滲透脫水的同時，低溫保護劑進入細胞內(nèi)部改變了細胞液體的熱力學(xué)性質(zhì)，快速降溫時可以實現(xiàn)胞內(nèi)和胞外的玻璃化，保持細胞結(jié)構(gòu)的完整和再生能力。新一代植物超低溫保存技術(shù)實現(xiàn)了對熱帶植物的保存，大大拓展了植物超低溫保存的范圍。

 

　　細胞膜是低溫傷害和滲透響應(yīng)的核心部位。玻璃化超低溫保存流程中，細胞經(jīng)受了劇烈和復(fù)雜的滲透和溫度變化，細胞的存活和死亡取決于細胞膜能否對上述脅迫做出有效響應(yīng)。長期以來，細胞膜對超低溫過程的響應(yīng)機理沒有得到解析，這也制約了超低溫技術(shù)的進一步發(fā)展。近日，中國科學(xué)院昆明植物研究所種子生物學(xué)研究組的林亮博士，陳虹穎副研究員，Hugh W. Pritchard 研究員與李唯奇研究員合作，以木蘭科植物厚樸的胚性細胞的超低溫保存體系作為模型系統(tǒng)，采用脂類組學(xué)分析方法，比較了12個不同超低溫處理的差異，揭示了細胞膜對玻璃化超低溫保存過程的響應(yīng)模式。結(jié)果顯示：滲透保護處理和復(fù)水處理兩個相對的過程，發(fā)生了磷脂酰膽堿（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）和磷脂酰肌酸（PA）和磷脂酰甘油（PG）的頭基團互換，進行了細胞膜重塑。PVS溶液處理后，總脂水平顯著升高，為細胞將要經(jīng)歷的冷凍過程儲備了大量脂類分子。該研究結(jié)果表明，膜脂重塑（lipid remodeling）和預(yù)防脂類降解是PVS方法成功的關(guān)鍵。從膜脂分子的角度對基于PVS的植物超低溫機理進行了解析，為改進玻璃化超低溫保存技術(shù)，拓展植物超低溫保存的通用性和應(yīng)用范圍提供了新思路。上述研究成果以“Lipid Remodeling Confers Osmotic Stress Tolerance to Embryogenic Cells during Cryopreservation”為題，在線發(fā)表在生物學(xué)領(lǐng)域雜志International Journal of Molecular Sciences上。

 

　　該項研究工作得到國家自然科學(xué)基金（NSFC 31770375，31500272），云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究項目（2017AB001）， 云南地方學(xué)院聯(lián)合基金（2018FH001-029），中國西南野生生物種質(zhì)資源庫“交叉合作團隊”開放研究項目，山東省農(nóng)業(yè)良種項目的資助（Grant No.2019LZGC01801）。