近日，華南農業(yè)大學生命科學學院、亞熱帶農業(yè)生物資源保護與利用國家重點實驗室、嶺南現代農業(yè)科學與技術廣東省實驗室劉耀光院士團隊在國際知名植物生物學學術期刊《Journal of Integrative Plant Biology》（IF2020=7.061，生物學一區(qū)）在線發(fā)表題為“The ScCas9++ variant expands the CRISPR toolbox for genome editing in plants”的研究論文（論文鏈接地址：https://www.jipb.net/EN/10.1111/jipb.13164）。該研究利用來源于狗鏈球菌的優(yōu)化的CRISPR/ScCas9++新變體，開發(fā)了廣靶向的植物基因組編輯與胞嘧啶單堿基編輯器，為植物功能基因組學研究和作物遺傳改良提供了新的研究工具。

 

　　目前，CRISPR/Cas基因組編輯技術已成為功能基因組學研究和作物遺傳改良的重要工具。但其編輯范圍常受到PAM基序及其編輯窗口的限制。因此，開發(fā)具有更廣泛PAM識別范圍的Cas變體是擴大CRISPR/Cas系統(tǒng)編輯使用范圍的一個重要研究方向。ScCas9是來源于狗鏈球菌（Streptococcus canis）的Cas9蛋白，與目前最常用的SpCas9蛋白（Streptococcus pyogenes,識別NGG-PAM）具有89.2%的高度相似性，識別靶向范圍更廣的NNG-PAM，但其在動、植物中的編輯效率都較低，難以推廣使用。前人通過對ScCas9的PAM-DNA互作結構域和loop基序中的氨基酸進行替換，獲得了進化型的ScCas9+和ScCas9++變體，并在動物細胞中表現出高的編輯活性和廣的編輯范圍。然而ScCas9+和ScCas9++變體在植物中的編輯能力如何仍然不清楚。

 

　　為了擴展植物CRISPR/Cas系統(tǒng)的靶向范圍，劉耀光院士團隊根據水稻密碼子偏好性優(yōu)化了ScCas9及其兩個進化的ScCas9+和ScCas9++變體的編碼DNA序列，系統(tǒng)地研究了它們對22個靶位點的編輯效率。結果發(fā)現ScCas9++的編輯效率比ScCas9和ScCas9+效率更高，但是它主要識別NGG-PAM靶點，而其它NNG靶點識別能力很低。該團隊利用編輯效率最高的缺刻酶變體ScCas9n++構建了一個具有evoBE4max結構的新的胞苷堿基編輯器（CBE）PevoCDA1-ScCas9n++，在NNG-PAM上實現了穩(wěn)定高效C?T的多重堿基編輯，并具有更寬的編輯窗口（C-1–C17），且沒有靶點序列的偏好。進一步利用PevoCDA1-ScCas9n++對OsWx（3靶點）和OsEui1（2靶點）同時進行多靶點編輯，高效地產生了直鏈淀粉含量降低的新的優(yōu)異水稻種質。

 

　　該研究為ScCas9++變體在植物基因組編輯中的進一步開發(fā)與應用打下了基礎、提供了思路。其缺刻酶變體ScCas9n++在堿基編輯器開發(fā)中具有更大的應用潛力。此CBE編輯器PevoCDA1-ScCas9n++為多靶點的單堿基編輯提供更為有效的工具，有望在基因功能篩選、大規(guī)模飽和突變、編輯調控元件、引入提前終止密碼子或進行可變剪接等研究中有廣泛應用。

 

　　生命科學學院碩士研究生劉濤利和博士后曾棟昌為論文的共同第一作者，劉耀光院士和祝欽瀧教授為論文的共同通訊作者。該研究獲得廣東省基礎與應用基礎研究重大項目、國家自然科學基金項目和廣東特支計劃科技創(chuàng)新青年拔尖人才專項的資助。（文/生命科學學院）