近期，江南大學(xué)生物工程學(xué)院饒志明教授團隊在L-谷氨酰胺的高效制備方面取得重要進(jìn)展，研究成果“Enhancing L-glutamine production inCorynebacterium glutamicumby rational metabolic engineering combined with a two-stage pH control strategy”正式發(fā)表于Bioresource Technology（IF = 9.642） （https://doi.org/10.1016/j.biortech.2021.125799）。

 

　　L-谷氨酰胺是一種半必需氨基酸，由于其特殊的營養(yǎng)及免疫功能，尤其是對腸胃潰瘍和大面積燒傷的治療具有重要作用，近年來被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和飼料等領(lǐng)域。目前，L-谷氨酰胺的生產(chǎn)方法主要有發(fā)酵法、酶法以及化學(xué)合成法。酶法合成L-谷氨酰胺存在操作復(fù)雜、產(chǎn)量低及反應(yīng)過程中需要額外加入大量價格昂貴的ATP等缺陷，而化學(xué)法合成L-谷氨酰胺存在著嚴(yán)重的環(huán)境污染等問題，因此目前常利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)L-谷氨酰胺。然而，缺乏高產(chǎn)量高轉(zhuǎn)化率的食品安全菌株以及發(fā)酵工藝的不成熟是限制L-谷氨酰胺工業(yè)生產(chǎn)的主要原因。

 

　　饒志明教授團隊針對上述發(fā)酵法生產(chǎn)L-谷氨酰胺過程中存在的產(chǎn)量低、轉(zhuǎn)化率低及工藝不成熟等問題，以谷氨酸棒桿菌為出發(fā)菌株，采用代謝工程改造結(jié)合兩階段pH調(diào)控策略高效制備L-谷氨酰胺。首先，通過ARTP誘變及高通量篩選獲得了一株產(chǎn)量為25.7±2.7 g/L的谷氨酸棒桿菌N01。接著，以N01為出發(fā)菌株進(jìn)行一系列的理性代謝工程改造，主要包括：（1）增強前體L-谷氨酸富集池及流向L-谷氨酰胺的碳通量。敲除proB基因，阻斷脯氨酸支路競爭途徑；敲除谷氨酸機械分泌通道蛋白NCgl1221，降低發(fā)酵液中副產(chǎn)物L(fēng)-谷氨酸含量，同時使更多的前體L-谷氨酸在胞內(nèi)積累從而促進(jìn)L-谷氨酰胺的高效合成。（2）提高關(guān)鍵酶谷氨酰胺合成酶（GS）的催化活性。敲除谷氨酰胺合成酶腺苷酰化轉(zhuǎn)移酶GlnE，解除GS的腺苷酰化作用；通過篩選8種不同來源的GS酶，獲得了一種釀酒酵母來源的具有高催化活性的GS，并用質(zhì)粒pXMJ19進(jìn)行異源過表達(dá)。（3）通過引入基于PPK的ATP再生系統(tǒng)增強胞內(nèi)ATP供應(yīng)。串聯(lián)表達(dá)大腸桿菌來源的多聚磷酸鹽激酶ppk，增強胞內(nèi)ATP再生。（4）利用RBS工程優(yōu)化串聯(lián)質(zhì)粒pXMJ19-glnA-ppk基因表達(dá)水平。最后，為解決菌體生長和發(fā)酵產(chǎn)酸之間的不平衡，提出了pH分階段調(diào)控策略并優(yōu)化了pH，從而實現(xiàn)了L-谷氨酰胺產(chǎn)量的大幅度增長。最終的工程菌在5L發(fā)酵罐中L-谷氨酰胺的最高產(chǎn)量為73.5±3.1 g/L，糖胺轉(zhuǎn)化率為0.368±0.034 g/g葡萄糖。本研究為已報道的利用谷氨酸棒桿菌生產(chǎn)L-谷氨酰胺的最高產(chǎn)量，為工業(yè)生產(chǎn)L-谷氨酰胺及相關(guān)的高價值產(chǎn)品提供了一系列有效的策略。

 

　　饒志明教授為論文的通訊作者，我校2019級碩士生呂青蘭為第一作者。上述研究得到了國家重點研發(fā)計劃項目（2021YFC2100900）、國家自然科學(xué)基金（31770058）以及寧夏回族自治區(qū)重點研發(fā)計劃項目（2019BCH01002）等資助。

 

　　近年來饒志明教授團隊以合成生物學(xué)科學(xué)理論為指導(dǎo)，在系統(tǒng)開展高效合成高值化合物細(xì)胞工廠構(gòu)建及產(chǎn)業(yè)化方面取得豐碩成果，相關(guān)研究成果已發(fā)表在Science Advances （2020）、Nature Communication （2018）、ACS Catalysis （2018）、Advanced Materials （2018）、Bioresource Technology （2017、2020）、Green Chemistry （2016）、metabolic Engineering （2016）等本領(lǐng)域權(quán)威期刊。