近日，園藝學(xué)院果樹逆境生物學(xué)團(tuán)隊(duì)管清美課題組在植物學(xué)頂級(jí)期刊《Plant Cell》在線發(fā)表了題為“Methylation of a MITE insertion in the MdRFNR1-1 promoter is positively associated with its allelic expression in apple in response to drought stress”的研究論文。該研究揭示了轉(zhuǎn)座子MITE-MdRF1通過影響MdRFNR1-1表達(dá)進(jìn)而調(diào)控蘋果抗旱的分子機(jī)制。轉(zhuǎn)座子（Transposable element, TE）廣泛分布于真核生物基因組中，是一種可移動(dòng)的DNA單元，通常情況處于沉默狀態(tài)以維持基因組的穩(wěn)定性。為了抑制其轉(zhuǎn)座活性，宿主基因組通過RdDM（RNA-directed DNA methylation）途徑使其DNA發(fā)生甲基化，進(jìn)而維持轉(zhuǎn)座子的表觀沉默。植物基因組中轉(zhuǎn)座子的插入對(duì)于植物來(lái)說(shuō)并非都有害處，轉(zhuǎn)座子會(huì)引入新的cis-element或者通過DNA的甲基化，從而產(chǎn)生遺傳和表觀遺傳的變異而產(chǎn)生新的基因表達(dá)模式，進(jìn)而影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育和抗逆性狀，例如血橙的紅色和玉米的抗旱。因此，轉(zhuǎn)座子并非是junk DNA片段，其對(duì)于推動(dòng)植物的進(jìn)化起到重要作用。然而，轉(zhuǎn)座子在植物逆境響應(yīng)中的作用仍知之甚少。干旱脅迫對(duì)于果樹的生長(zhǎng)發(fā)育及果園的生態(tài)完整性影響重大，植物通過多種機(jī)制應(yīng)對(duì)干旱脅迫，氧化還原途徑是植物耐旱機(jī)制的重要組成部分。RFNR（Root-type ferredoxin-NADP+ oxidoreductase，根型鐵氧還蛋白-NADP+氧化還原酶）被報(bào)道參與植物體內(nèi)的氧化還原平衡，然而其是否參與抗旱還未曾報(bào)道，植物RFNR是否存在自然變異而影響抗旱并不清楚。

 

　　該課題組從PEG模擬干旱處理的RNA-seq數(shù)據(jù)中發(fā)掘到RFNR1基因，其表達(dá)受PEG誘導(dǎo)表達(dá)。鑒于蘋果的雜合性，研究人員以GL-3（皇家嘎啦的實(shí)生后代，用于蘋果轉(zhuǎn)基因的背景材料，二倍體）為研究對(duì)象，從中克隆得到蘋果RFNR1的等位基因MdRFNR1-1和MdRFNR1-2，這兩個(gè)等位基因編碼的蛋白具有三個(gè)氨基酸的差異，但體外酶活實(shí)驗(yàn)和轉(zhuǎn)基因愈傷的PEG處理實(shí)驗(yàn)表明其功能并無(wú)差異，均能對(duì)NADPH起到催化作用及對(duì)干旱脅迫起正調(diào)控功能。隨后，RFNR1的功能在轉(zhuǎn)基因植物中得到驗(yàn)證。

 

　　該研究發(fā)現(xiàn)，MdRFNR1的兩個(gè)等位基因表達(dá)水平存在差異，MdRFNR1-1的表達(dá)水平顯著高于MdRFNR1-2，PEG誘導(dǎo)MdRFNR1-1表達(dá)而非MdRFNR1-2。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)MdRFNR1-1的啟動(dòng)子區(qū)域存在MITE的插入，并命名為MITE-MdRF1。GUS實(shí)驗(yàn)表明MITE-MdRF1在促進(jìn)基因表達(dá)及干旱脅迫的誘導(dǎo)中起到重要作用。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)表明，MITE-MdRF1對(duì)于MdRFNR1-1的調(diào)控在蘋果抗旱中起正調(diào)控功能。

 

　　通過PCR基因分型發(fā)現(xiàn)，在檢測(cè)的371個(gè)蘋果品種和資源中，有30個(gè)蘋果種質(zhì)的RFNR1啟動(dòng)子中存在MITE-MdRF1插入。為了進(jìn)一步確認(rèn)MITE-MdRF1插入RFNR1啟動(dòng)子與蘋果自然背景下的耐旱性之間的聯(lián)系，研究人員挑選了部分種質(zhì)進(jìn)行葉片失水處理并測(cè)定POD（過氧化物酶）和CAT（過氧化氫酶）活性以及MDA（丙二醛，反應(yīng)干旱脅迫下細(xì)胞完整性）含量。結(jié)果表明，在葉片失水處理后，RFNR1啟動(dòng)子區(qū)域含有MITE-MdRF1插入的種質(zhì)具有更高的POD和CAT活性，以及更低的MDA累積。

 

　　研究進(jìn)一步表明MITE-MdRF1處具有24-nt sRNA的積累，可能會(huì)通過RdDM途徑而引起DNA的甲基化，locus-specific BS-seq、McrBC-qPCR及5-AZA（DNA甲基化抑制劑）處理證明MITE-MdRF1發(fā)生甲基化，且甲基化程度受PEG模擬干旱誘導(dǎo)。

 

　　甲基化程度升高通常會(huì)抑制基因的表達(dá)，而本研究表明甲基化程度與基因表達(dá)正相關(guān)，基于前人的報(bào)道，研究人員對(duì)其可能的機(jī)制進(jìn)行了深入研究。SUVH1和SUVH3可作為DNA甲基化識(shí)別蛋白，通過招募DNAJ1和DNAJ2蛋白形成蛋白復(fù)合體，進(jìn)而促進(jìn)基因表達(dá)。本研究通過DAP-qPCR及雙熒光素酶試驗(yàn)證明蘋果中MdSUVH1和MdSUVH3可結(jié)合于甲基化MITE-MdRF1，并通過與MdDNAJ1、MdDNAJ2和MdDNAJ5形成蛋白復(fù)合體進(jìn)而激活MdRFNR1-1基因的表達(dá)。隨后通過轉(zhuǎn)基因植物和蘋果愈傷組織證明了MdSUVH1和MdDNAJ1在促進(jìn)蘋果抗旱中的功能。

 

　　綜上所述，該研究揭示了干旱脅迫條件下MITE的插入對(duì)MdRFNR1-1順式調(diào)節(jié)中的作用，并且這項(xiàng)工作提供了一個(gè)額外的案例，其中TE插入和DNA甲基化與轉(zhuǎn)錄呈正相關(guān)。

 

　　博士研究生牛春東、姜麗娟及曹富國(guó)為該論文共同第一作者，管清美教授為該論文通訊作者，馬鋒旺教授及李超教授在本研究中提供了指導(dǎo)與幫助。本研究得到國(guó)家自然科學(xué)基金（32172530）、深圳市中央引導(dǎo)地方科技發(fā)展專項(xiàng)資金（2021SZVUP117）、陜西省科技重大專項(xiàng)（2020zdzx03-01-02）及博士后科學(xué)基金（2021M702692）的資助。

 

　　文章鏈接：https://doi.org/10.1093/plcell/koac220