食品伙伴網(wǎng)訊  2019年5月6日，臺灣衛(wèi)福部食藥署發(fā)布衛(wèi)授食字第1081900523號通知，預(yù)告訂定《食品中海洋生物毒素之檢驗(yàn)方法－神經(jīng)性貝類毒素之檢驗(yàn)》草案。具體內(nèi)容如下附件。

 

　　附件：

 

　　食品中海洋生物毒素之檢驗(yàn)方法－神經(jīng)性貝類毒素之檢驗(yàn)（草案）

 

　　1. 適用范圍：本檢驗(yàn)方法適用于貝類中神經(jīng)性貝類毒素（neurotoxicshellfish poison, NSP）之檢驗(yàn)。

 

　　2. 檢驗(yàn)方法：檢體經(jīng)萃取后，以小鼠生物試驗(yàn)（mouse bioassay）之方法。

 

　　2.1. 裝置：

 

　　2.1.1. 均質(zhì)機(jī)（Homogenizer）。

 

　　2.1.2. 減壓濃縮機(jī)（Rotary evaporator）。

 

　　2.1.3. 振蕩器（Shaker）。

 

　　2.1.4. 離心機(jī)：可達(dá)6000 × g以上。

 

　　2.2. 試藥：鹽酸、無水乙醚、Tween-60、氯化鈉及次氯酸鈉均采用試藥特級；去離子水（比電阻于25℃可達(dá)18 MΩ•cm以上）。

 

　　2.3. 器具及材料：

 

　　2.3.1. 離心瓶： 500 mL，PP材質(zhì)。

 

　　2.3.2. 容量瓶：100 mL及1000 mL。

 

　　2.3.3. 分液漏斗：500 mL。

 

　　2.3.4. 燒杯：500 mL。

 

　　2.3.5. 減壓濃縮瓶：500 mL。

 

　　2.3.6. 布氏漏斗。

 

　　2.3.7. 金屬篩網(wǎng)：孔徑2 mm。

 

　　2.3.8. 刀片或小刀。

 

　　2.3.9. 注射針：1 mL，針頭25 G以上。

 

　　2.3.10. 計時器。

 

　　2.4. 試驗(yàn)動物：ICR品系雄性小鼠，體重14～20 g。

 

　　2.5. 試劑之調(diào)制：

 

　　2.5.1. 0.85%氯化鈉溶液：稱取氯化鈉0.85 g，以去離子水溶解使成100 mL。

 

　　2.5.2. 1% Tween-60氯化鈉溶液：稱取Tween-60 1 g，以0.85%氯化鈉溶液溶解使成100 mL。

 

　　2.5.3. 5%次氯酸鈉溶液：稱取次氯酸鈉50 g，以去離子水溶解使成1000 mL。

 

　　2.6. 檢體前處理（注1）：

 

　　2.6.1. 生鮮含殼貝類檢體：

 

　　用水將檢體外殼徹底洗凈，以刀片或小刀切斷閉殼肌開殼，用水沖洗內(nèi)部去除泥沙及其他外來物。將閉殼肌和連接在絞合部之組織分開，取出貝肉，勿割破肉體。開殼前不可加熱或使用麻醉劑。稱取貝肉200 g置于金屬篩網(wǎng)上，瀝水5分鐘，去除碎殼等雜物，將貝肉均質(zhì)后備用。

 

　　2.6.2. 冷凍檢體：

 

　　檢體于室溫下退冰成半冷凍狀態(tài)。帶殼檢體按2.6.1.節(jié)清洗、開殼、沖洗取出貝肉及除去貝肉外部附著之冰片，擦干水分后于室溫下回溫。稱取貝肉200 g置于金屬篩網(wǎng)上，瀝水5分鐘，將貝肉均質(zhì)后備用。

 

　　2.6.3. 貝類罐頭：

 

　　將檢體內(nèi)容物瀝干水分，倒入均質(zhì)機(jī)均質(zhì)后備用。

 

　　2.6.4. 貝類干制品：

 

　　稱取檢體100 g，加入足量清水，于4℃冷藏浸泡24～48小時，瀝干水分后均質(zhì)備用。

 

　　2.6.5. 腌漬品：

 

　　檢體先以水洗，去除鹽分，瀝干水分后均質(zhì)備用。

 

　　注1：每種貝類檢體至少要取10個以上，且貝肉需達(dá)200 g以上。冷凍檢體送驗(yàn)時須為冷凍狀態(tài)或運(yùn)送溫度應(yīng)保持0～10℃。

 

　　2.7. 檢液之調(diào)制：

 

　　取2.6.節(jié)均質(zhì)后檢體100 g，置于燒杯中，加入氯化鈉5 g及鹽酸1mL，加熱攪拌至沸騰，轉(zhuǎn)小火煮5分鐘，冷卻至室溫，移入離心管瓶，以無水乙醚50 mL清洗燒杯，洗液并入離心瓶中，再加入無水乙醚100 mL，蓋上蓋子充分振蕩，以6000 × g離心15分鐘。將上層液移至分液漏斗中，殘?jiān)僖詿o水乙醚250 mL分三次重復(fù)萃取，將無水乙醚層并入分液漏斗中，輕輕振搖，避免生成乳濁液，靜置分層，去除下層水層及貝肉碎片，將上層無水乙醚層移入減壓濃縮瓶中，于35℃減壓濃縮去除無水乙醚，殘留物以1% Tween-60氯化鈉溶液清洗至最終體積為10mL，混合均勻，供作檢液。

 

　　2.8. 小鼠生物試驗(yàn)操作：

 

　　取檢液各1 mL，分別注入3只小鼠腹腔^（注2），觀察是否使試驗(yàn)動物產(chǎn)生特異性臨床征狀，如呼吸困難、步履蹣跚、翻滾、四肢抽搐等，并以計時器記錄致死時間。自注射起連續(xù)觀察930分鐘，若小鼠的中間致死時間（第2只小鼠死亡時間）在2小時以內(nèi)，則用1% Tween-60氯化鈉溶液稀釋檢液后重新注射另外3只小鼠，直到小鼠的中間致死時間在2～6小時內(nèi)。另取1%Tween-60氯化鈉溶液1 mL作空白對照組，同檢液組操作。

 

　　注2：注射時若有檢液溢出，須將該小鼠丟棄，并重新注射一只。

 

　　2.9. 檢體毒素劑量之計算：

 

　　由檢液組或稀釋液組中各小鼠死亡時間參照致死時間－小鼠單位換算表（附表一），查出對應(yīng)之小鼠單位，與小鼠體重－小鼠單位校正表（附表二）之校正系數(shù)相乘，求得各小鼠CMU_（i），取各小鼠CMU_（i）之中位數(shù)（CMU_（g））^（注3），并依下列計算式求出檢體毒素劑量（MU/kg）：

 

　　

 

　　CMU（g）：檢液組或稀釋液組中各小鼠CMU（i）的中位數(shù)（MU/mL）

 

　　F：檢液稀釋倍數(shù)

 

　　W：檢液1 mL相當(dāng)之檢體重量（g/mL）

 

　　注3：若檢液組或稀釋液組僅2只小鼠于930分鐘內(nèi)死亡，計算2只小鼠CMU_（i），取較小CMU_（i）為CMU_（g），計算檢體毒素劑量；若檢液組僅1只小鼠于930分鐘內(nèi)死亡，或所有小鼠均不死亡，則檢體毒素劑量以< 100 MU/kg表示。

 

　　附注：手套、玻璃制品等用過器材，及廢棄萃取液應(yīng)浸泡5%次氯酸

 

　　鈉溶液1小時以上，使毒素分解，再作清洗或丟棄。

 

　　參考文獻(xiàn)：

 

　　1. American Public Health Association. 1970. Recommended procedures for the examination of sea water and shellfish. 4thEdition. pp. 61-66. APHA. New York, NY, USA.

 

　　2. 國家食品藥品監(jiān)督管理總局。 2016。食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)貝類中神經(jīng)性貝類毒素的 測 定。中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)。GB5009.261。

 

　　附表一、神經(jīng)性貝類毒素之致死時間－小鼠單位換算表
            

 

　　附表二、小鼠體重－小鼠單位之校正表
             

 

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