12月10日，中國(guó)科學(xué)院分子植物科學(xué)卓越創(chuàng)新中心/植物生理生態(tài)研究所巫永睿研究組團(tuán)隊(duì)在Communications Biology 雜志上在線(xiàn)發(fā)表題為High frequency DNA rearrangement at qγ27 creates a novel allele for Quality Protein Maize breeding 的研究文章。優(yōu)質(zhì)蛋白玉米胚乳修飾因子qγ27位點(diǎn)結(jié)構(gòu)高度不穩(wěn)定，該團(tuán)隊(duì)通過(guò)巧妙遺傳設(shè)計(jì)深入解析了該位點(diǎn)發(fā)生非法重組的頻率及基因重排的分子遺傳機(jī)制。
基因拷貝數(shù)變異（Copy Number Variation, CNV）是驅(qū)動(dòng)物種基因組動(dòng)態(tài)變化的主要?jiǎng)恿χ弧NV可由基因復(fù)制、缺失及插入引起，它可直接導(dǎo)致基因表達(dá)的劑量差異，引起種內(nèi)個(gè)體間表型不同程度的變異，或者新拷貝發(fā)生新的變異，從而演化出不同于原始拷貝的表達(dá)模式，甚至進(jìn)化出新的功能。人類(lèi)基因組有3000 Mbp，4.8-9.5%是由CNV貢獻(xiàn)的，在群體多態(tài)性形成中扮演重要作用。玉米基因組有2200 Mbp，大量基因存在基因復(fù)制，而CNV是影響不同自交系間表型差異的主要來(lái)源之一。CNV主要通過(guò)基因同源重組發(fā)生。在減數(shù)分裂時(shí)，如果同源染色體上的不同基因拷貝發(fā)生完全等位配對(duì)，任何染色體交換（crossover）都不會(huì)引起CNV；如果不同基因拷貝之間發(fā)生了非等位配對(duì)，這個(gè)區(qū)間的染色體交換就會(huì)導(dǎo)致基因重排：一條染色體失去一個(gè)或多個(gè)拷貝，另外一條得到相應(yīng)數(shù)量的拷貝，這稱(chēng)之為非法重組。正常的同源重組頻率很容易通過(guò)發(fā)生交換兩側(cè)的標(biāo)記算出，然而非法重組的頻率很少有直接通過(guò)遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)精確測(cè)定的報(bào)道。
30年前，美國(guó)羅格斯大學(xué)Joachim Messing實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)玉米27-kDa γ-醇溶蛋白編碼基因（γ27）在不同玉米自交系間存在拷貝數(shù)變異，有些自交系含有兩個(gè)拷貝，有些只含有一個(gè)。Messing實(shí)驗(yàn)室通過(guò)Southern Blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)含兩個(gè)γ27拷貝的等位位點(diǎn)（Standard allele, S）可以通過(guò)基因重排變成一個(gè)拷貝（Rearranged allele, R），然而由于受到實(shí)驗(yàn)體系的限制，這個(gè)位點(diǎn)由非法重組導(dǎo)致的基因重排頻率一直無(wú)法測(cè)定。玉米主要儲(chǔ)藏蛋白是缺乏必需氨基酸賴(lài)氨酸的醇溶蛋白。Opaque2（O2）轉(zhuǎn)錄因子主要調(diào)控含量最高的α-醇溶蛋白，在o2突變體中，α-醇溶蛋白大量下降，富含賴(lài)氨酸的其他蛋白互補(bǔ)性上調(diào)，因此提高了玉米的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)。然而o2突變體是粉質(zhì)表型，不能直接進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化。優(yōu)質(zhì)蛋白玉米（Quality Protein Maize, QPM）以o2突變體為高賴(lài)氨酸供體，通過(guò)聚合多個(gè)胚乳修飾因子恢復(fù)成硬質(zhì)而育成。前期研究發(fā)現(xiàn)優(yōu)質(zhì)蛋白玉米高表達(dá)γ27醇溶蛋白是粉質(zhì)胚乳恢復(fù)成硬質(zhì)所必需，后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)優(yōu)質(zhì)蛋白玉米高表達(dá)γ27醇溶蛋白是因?yàn)楹袃蓚€(gè)γ27拷貝的S等位基因，說(shuō)明這個(gè)S等位基因在優(yōu)質(zhì)蛋白玉米育種中受到了人工選擇。由于很多大芻草（野生玉米）也含有S等位基因，暗示γ27的基因復(fù)制發(fā)生在玉米馴化之前，而目前玉米自交系含有的單拷貝基因（R等位基因）是S等位基因發(fā)生基因重排產(chǎn)生的（圖1a）。普通玉米自交系含有R或S等位基因?qū)ψ蚜１硇蜎](méi)有任何影響，雖然優(yōu)質(zhì)蛋白玉米胚乳修飾必須依賴(lài)S等位基因，但其修飾程度受多個(gè)因子調(diào)控及環(huán)境影響。因此，通過(guò)籽粒表型篩選S等位基因的重排子很不可靠。
巫永睿研究組團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了一系列巧妙的遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)測(cè)定了S等位基因的重排頻率（圖1）。第一個(gè)關(guān)鍵設(shè)計(jì)：他們發(fā)現(xiàn)這個(gè)基因重復(fù)片段包含兩個(gè)基因，分別是γ27 和 ARID4。ARID4在基因復(fù)制后在其3‘端產(chǎn)生了一個(gè)1923-bp的缺失。利用這個(gè)InDel設(shè)計(jì)一對(duì)PCR引物就可以知道某個(gè)材料含有S（PCR產(chǎn)物是兩條帶）或R等位基因（PCR產(chǎn)物僅為一條大帶或小帶）；第二個(gè)關(guān)鍵設(shè)計(jì)：PCR標(biāo)記是顯性遺傳的，如果父本或母本只有一方發(fā)生基因重排，在自交后代中重排帶型與S帶型重疊，無(wú)法判斷上代減數(shù)分裂中是否發(fā)生了基因重排。論文合作者Nebraska州立大學(xué)的David Holding實(shí)驗(yàn)室用γ射線(xiàn)輻射誘變優(yōu)質(zhì)蛋白玉米K0326Y，創(chuàng)制了該材料的基因組大片段缺失體庫(kù)，其中一個(gè)材料的S等位基因位點(diǎn)全部缺失（K0326Y-deletion, K-D）。巫永睿團(tuán)隊(duì)把含有S等位基因位點(diǎn)的不同自交系與K-D材料做正反雜交，那么S等位基因無(wú)論在父本或母本減數(shù)分裂時(shí)產(chǎn)生的單拷貝，都可在下一代被PCR引物檢測(cè)到。通過(guò)45000多個(gè)PCR樣本檢測(cè)，該團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)了58個(gè)重排子，因此S等位基因從上一代到下一代發(fā)生基因重排的頻率是1.27 x 10-3。這個(gè)頻率比人類(lèi)基因組中檢測(cè)到的幾個(gè)高頻重排位點(diǎn)高了100-1000倍，這與玉米自交系基因組變異巨大是一致的。他們還發(fā)現(xiàn)A188自交系（2.67 x 10-3） 和K0326Y優(yōu)質(zhì)蛋白玉米（2.22 x 10-3）分別從母本和父本遺傳具有最高重排頻率，而W22自交系的父母本重排頻率在所有材料中都是最低的（0.69 x 10-3和0.83 x 10-3），說(shuō)明不同自交系或同一自交系的父母本在減數(shù)分裂時(shí)在S等位基因位點(diǎn)形成的非法重組交換次數(shù)是有差異的。玉米很多經(jīng)典突變事件頻率都是可以通過(guò)遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)測(cè)量的，比如Adh1和C1基因發(fā)生自發(fā)突變的頻率數(shù)量級(jí)是10-7，Ac轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座頻率數(shù)量級(jí)是10-7，后者與S等位基因發(fā)生重排的頻率相當(dāng)；第三個(gè)關(guān)鍵設(shè)計(jì)：基因重排導(dǎo)致一條染色體失去基因拷貝的同時(shí)，另一條染色體會(huì)得到相應(yīng)的拷貝數(shù)，但是三個(gè)拷貝重復(fù)的PCR帶型與兩個(gè)拷貝的一致，無(wú)法通過(guò)上述方法鑒定到。UniformMu轉(zhuǎn)座子突變體庫(kù)是以含S等位基因的W22自交系建立的，每個(gè)突變體都是從單粒種子自交擴(kuò)繁的。如果某些突變體在建庫(kù)之初發(fā)生了基因重排，那么三拷貝的等位基因就會(huì)被保留在UniformMu群體中。研究人員利用定量PCR方法果然篩選到了三拷貝γ27基因的材料。
三拷貝等位位點(diǎn)比兩拷貝增加了γ27基因的mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成。通過(guò)透射電鏡觀察胚乳淀粉細(xì)胞發(fā)現(xiàn)三拷貝材料的蛋白體數(shù)目和大小都有顯著增加。當(dāng)研究人員把特異爭(zhēng)對(duì)α-醇溶蛋白基因的RNAi轉(zhuǎn)基因?qū)肴截?gamma;27材料中時(shí)，聚合材料不僅含高賴(lài)氨酸品質(zhì)，而且胚乳表現(xiàn)硬質(zhì)，說(shuō)明三拷貝γ27等位基因可以在UniformMu材料背景下修飾α-醇溶蛋白基因沉默導(dǎo)致的粉質(zhì)表型，暗示其將成為一個(gè)優(yōu)良等位修飾位點(diǎn)用于優(yōu)質(zhì)蛋白玉米育種。
山東農(nóng)業(yè)大學(xué)作物生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室教授劉紅軍、中科院分子植物卓越中心博士生黃永財(cái)和山東農(nóng)業(yè)大學(xué)博士生李曉寒為論文共同第一作者。用于該研究的優(yōu)質(zhì)蛋白玉米輻射誘變材料由美國(guó)內(nèi)布拉斯加州立大學(xué)林肯分校植物科學(xué)創(chuàng)新中心教授David R. Holding提供，上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院王文琴研究組參與了合作。巫永睿為通訊作者。研究工作得到國(guó)家自然科學(xué)基金、中國(guó)科技部和中科院等的資助。
分子植物卓越中心等通過(guò)測(cè)定非法重組頻率挖掘優(yōu)質(zhì)蛋白玉米修飾基因
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