南湖新聞網(wǎng)訊 近日， 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)棉花遺傳改良團隊教授金雙俠和山東棉花研究中心遺傳育種團隊研究員柳展基在國際期刊Plant Biotechnology Journal合作發(fā)表了題為“High oleic acid content, nontransgenic allotetraploid cotton （Gossypium hirsutum L.） generated by knockout of GhFAD2 genes with CRISPR/Cas9 system”的研究論文，介紹了利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)創(chuàng)制非轉(zhuǎn)基因高油酸棉花新種質(zhì)的研究結(jié)果。
作為單不飽和脂肪酸，油酸具有較高的穩(wěn)定性，在烹調(diào)過程中不易產(chǎn)生反式脂肪酸，被營養(yǎng)學(xué)界譽為“安全脂肪酸”。市場上常見的橄欖油和茶籽油，油酸含量均達到70%以上，但價格較為昂貴。高油酸花生來源于自然突變體F435或誘變突變體，油酸含量高達80%。2017年魯花集團推出高油酸花生油，其價格約為普通花生油的2倍，因其營養(yǎng)價值高、無反式脂肪酸，贏得了消費者的青睞。杜邦先鋒公司發(fā)布的Plenish高油酸大豆是利用TALEN基因編輯技術(shù)獲得的，與傳統(tǒng)大豆相比，其油酸含量由21%提高至76.5%，亞油酸含量由52.5%降至3.6%，亞麻酸含量也顯著降低。這使得Plenish高油酸大豆的脂肪酸組成與橄欖油和茶籽油更加接近，被貼以“用大豆生產(chǎn)橄欖油”的標簽，其價格也相應(yīng)地大幅提高。
棉籽油是我國第五大食用植物油，其油酸含量較低，為14.7%-21.7%；而亞油酸含量較高，為46.7%-58.2%。盡管亞油酸具有降低血液膽固醇、預(yù)防動脈粥樣硬化的作用，但受其不飽和程度高、性質(zhì)不穩(wěn)定、抗氧化性能較弱、易酸敗、貨架期較短等因素的影響，棉籽油品質(zhì)仍有待提升。
FAD2基因是油脂合成代謝過程中的關(guān)鍵基因，其編碼的Δ12-脂肪酸脫飽和酶催化油酸（C18:1）進一步脫飽和形成亞油酸（C18:2）。陸地棉為異源四倍體，其基因組中含有8個FAD2同源基因，其中GhFAD2-1A/D與擬南芥FAD2基因相似性最高，親緣關(guān)系最近。表達分析發(fā)現(xiàn)，GhFAD2-1A/D主要在種子中表達，尤其在種子發(fā)育中后期，表達量更高，預(yù)示其在調(diào)控棉花種子油分組成中發(fā)揮的重要作用。
利用CRISPR/Cas9敲除GhFAD2基因創(chuàng)制非轉(zhuǎn)基因高油酸棉花
該研究以棉花GhFAD2-1A/D基因為靶標，分別在其DUF3474和Fatty acid desaturase結(jié)構(gòu)域設(shè)計了2個靶點，利用pRGEB32-GhU6.9-NPT II 載體構(gòu)建了GhFAD2-1A/D基因的雙靶點編輯載體，通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化棉花品系Jin668，獲得了35株獨立的T0代再生植株。經(jīng)PCR檢測，發(fā)現(xiàn)25株（71.43%）含有編輯載體上的NPTII和Cas9基因。利用Sanger測序檢測產(chǎn)生的突變，研究發(fā)現(xiàn)2個靶點均有突變發(fā)生。在25株陽性獨立植株中，有19株（有效率76%）在目標位點檢測到突變。突變類型以單堿基插入缺失為主，同時也檢測到了長片段堿基缺失，為2個sgRNA共同作用的結(jié)果。利用PCR和Sanger測序檢測T1植株，團隊發(fā)現(xiàn)所有T0突變均穩(wěn)定遺傳到T1代，T1代中也發(fā)現(xiàn)了新的突變。尤為重要的是，在T1代中檢測到了4個無載體篩選標記基因的突變單株，被稱為非轉(zhuǎn)基因（nontransgenic）突變株。棉花基因組中含有21個GhFAD成員，團隊利用Sanger測序詳細分析了19個潛在的脫靶位點，結(jié)果未檢測到脫靶效應(yīng)；利用GC-MS分析了4個非轉(zhuǎn)基因突變單株種子的脂肪酸組分，與對照Jin668相比，突變體種子中的油酸含量顯著升高，亞油酸含量顯著降低。本研究還檢測了高油酸突變體的主要農(nóng)藝性狀，發(fā)現(xiàn)敲除GhFAD2-1A/D基因并不影響棉花產(chǎn)量、纖維品質(zhì)、種子總油分含量和種子萌發(fā)率。
金雙俠和柳展基為本論文的通訊作者，山東棉花研究中心博士陳義珍為第一作者，山東棉花研究中心傅明川、李浩、王立國和劉任重以及我校張獻龍教授也參與了這項工作。該研究受到了國家自然科學(xué)基金和山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新工程的支持。
原文鏈接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1111/pbi.13507
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