植物基因編輯的一個(gè)關(guān)鍵步驟是將Cas9蛋白和sgRNA遞送到植物細(xì)胞中發(fā)揮作用,目前植物中的遞送方式主要有農(nóng)桿菌和基因槍轉(zhuǎn)化兩種,均需要通過較長時(shí)間的組織培養(yǎng)和再生才能夠獲得完整的突變體植株。然而,組織培養(yǎng)和再生仍是植物基因編輯的限速步驟,對(duì)于一些單子葉植物,尤其是對(duì)于包含龐大且復(fù)雜的六倍體基因組的普通小麥,其基因組編輯尤為困難。開發(fā)出無須組織培養(yǎng)且不受基因型限制的遞送系統(tǒng)是植物基因組編輯需要解決的關(guān)鍵技術(shù)問題。
中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所高彩霞團(tuán)隊(duì)和中國農(nóng)業(yè)大學(xué)李大偉團(tuán)隊(duì)合作,開發(fā)出基于大麥條紋花葉病毒(BSMV)的sgRNA遞送載體系統(tǒng)——BSMV-sg,在小麥中建立了高效、可遺傳、不需要組織培養(yǎng)的基因組編輯遞送系統(tǒng)。該研究將sgRNA搭載到BSMVγ上構(gòu)建出BSMVγ-sg系統(tǒng),通過利用移動(dòng)RNA元件(mAtFT、mTaFT以及tRNA)對(duì)sgRNA進(jìn)行修飾,以期促進(jìn)BSMV病毒向分生組織細(xì)胞的移動(dòng)能力來提高可遺傳的編輯效率。結(jié)果表明,不修飾的BSMVγ-sg對(duì)小麥葉片中具有較高的侵染能力和編輯活性。進(jìn)一步將BSMV-sg系統(tǒng)對(duì)三個(gè)小麥Cas9表達(dá)品種的三個(gè)基因分別進(jìn)行編輯,研究人員發(fā)現(xiàn),BSMV-sg均能夠在病毒侵染植株的后代獲得高效的可遺傳突變,效率為12.9%-100%,且純和突變體效率為1.6%-7.7%。此外,研究還發(fā)現(xiàn),超過53.8%的突變體后代均不含病毒(virus-free)。通過混合含有多個(gè)靶點(diǎn)的BSMV-sg農(nóng)桿菌并侵染小麥,可實(shí)現(xiàn)多基因編輯。最后,研究人員將BSMV-sg侵染的Cas9轉(zhuǎn)基因小麥花粉與野生型小麥進(jìn)行雜交,在F2代可獲得不含Cas9(Cas9-free)的突變體后代。BSMV-sg介導(dǎo)的小麥基因組編輯遞送系統(tǒng)具有高效、低成本、無須組織培養(yǎng)和再生過程的特點(diǎn),可應(yīng)用于小麥大規(guī)模和高通量基因組編輯,為小麥功能基因研究和分子設(shè)計(jì)育種提供了重要的技術(shù)支持。
該項(xiàng)研究成果于7月14日在線發(fā)表于Molecular Plant(DOI:10.1016/j.molp.2021.07.010)。該研究得到了中科院戰(zhàn)略性先導(dǎo)科技專項(xiàng)(A類)、國家自然科學(xué)基金、農(nóng)業(yè)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題和中科院青年創(chuàng)新促進(jìn)會(huì)的支持。
圖:BSMV介導(dǎo)的高效小麥基因編輯遞送系統(tǒng)。A.BSMV基因組編輯載體示意圖;B.BSMV-sg介導(dǎo)的小麥基因組編輯流程示意圖;C.BSMV-sg實(shí)現(xiàn)高效的可遺傳編輯;D.BSMV-sg誘導(dǎo)小麥TaPDS靶基因突變并呈現(xiàn)葉片白化表型