近期，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院劉紅林教授、申明副研究員團(tuán)隊(duì)在豬卵泡發(fā)育的分子機(jī)制研究中取得重要進(jìn)展，兩篇高水平研究論文“Oocytes and hypoxanthine orchestrate the G2-M switch mechanism in ovarian granulosa cells”和“FOXO1 mediates hypoxia-induced G0/G1 arrest in ovarian somatic granulosa cells by activating the TP53INP1-p53-CDKN1A pathway”連續(xù)發(fā)表在發(fā)育生物學(xué)權(quán)威雜志《Development》。

 

　　雌性動(dòng)物出生后，卵母細(xì)胞一直停滯在減數(shù)第I次分裂前期的雙線期。直至初情期到來(lái)后，在LH激素峰的作用下，減數(shù)分裂才能重新啟動(dòng)。早在上世紀(jì)80年代，美國(guó)科學(xué)院院士John Eppig教授發(fā)現(xiàn)卵泡液中含有抑制卵母細(xì)胞自發(fā)恢復(fù)減數(shù)分裂的小分子物質(zhì)。次黃嘌呤（Hx）被證明是這些小分子抑制物中的主要活性成分，可通過(guò)抑制磷酸二酯酶的活性提高cAMP水平，抑制卵母細(xì)胞促成熟因子（MPF，即CDKl/cyclin B復(fù)合物）活性，從而維持卵母細(xì)胞減數(shù)分裂抑制。卵泡顆粒細(xì)胞與卵母細(xì)胞處于相同的卵泡環(huán)境中，顆粒細(xì)胞的增殖同樣需要MPF活性，但次黃嘌呤對(duì)顆粒細(xì)胞增殖的影響卻缺少報(bào)道。

 

　　本研究首次證明，生理濃度的Hx能夠通過(guò)抑制MPF活性，將顆粒細(xì)胞阻斷在G2期，并且這種抑制作用的解除依賴于TGF-β1的添加，而不是FSH、LH、IGF1、EGF等激素或生長(zhǎng)因子。進(jìn)一步研究揭示，在卵泡中，卵母細(xì)胞可通過(guò)分泌GDF9和BMP15這兩種TGF-β超家族成員解除Hx引起的顆粒細(xì)胞有絲分裂阻滯，其機(jī)制在于：GDF9和BMP15與顆粒細(xì)胞上的GDF9/BMP15受體結(jié)合后，通過(guò)激活ERK1/2通路，抑制Wee1活性，從而抑制CDK1的Thr l4和Tyr l5位點(diǎn)磷酸化。ERK1/2還可激活CDC25B磷酸酶活性，進(jìn)一步降低Thr l4和Tyr l5這兩個(gè)位點(diǎn)磷酸化水平，從而增強(qiáng)CDK1活性，使被Hx抑制的MPF活性得以恢復(fù)，因此誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞從G2進(jìn)入M期，促進(jìn)有絲分裂的進(jìn)行。值得注意的是，GDF9/BMP15受體含量較低的顆粒細(xì)胞不僅對(duì)Hx誘導(dǎo)的G2期阻滯更敏感，而且更容易從卵泡壁脫落成為游離顆粒細(xì)胞（dGCs）。同時(shí)，Hx誘導(dǎo)的G2期阻滯會(huì)引發(fā)dGCs的凋亡。由于顆粒細(xì)胞脫落和凋亡是卵泡發(fā)生閉鎖的重要特征，可以預(yù)見(jiàn)顆粒細(xì)胞GDF9及BMP15受體的差異表達(dá)可能是引起卵泡選擇性閉鎖的潛在原因。

 

　　卵泡發(fā)育是雌性生殖的基礎(chǔ)，卵母細(xì)胞減數(shù)分裂抑制和顆粒細(xì)胞有絲分裂增殖是確保卵泡正常發(fā)育必須具備的兩個(gè)基本條件。然而，在同一卵泡環(huán)境中如何實(shí)現(xiàn)二者的協(xié)調(diào)統(tǒng)一尚缺乏足夠的認(rèn)識(shí)。本研究為這一問(wèn)題的回答提供了可能性的解釋，加深了人們對(duì)卵泡發(fā)育機(jī)制的了解。另一方面，目前尚不明確卵母細(xì)胞是否參與卵泡閉鎖的啟動(dòng)。本研究表明，Hx抑制細(xì)胞增殖后顯著增加了顆粒細(xì)胞凋亡；而卵母細(xì)胞分泌因子可消除Hx對(duì)顆粒細(xì)胞有絲分裂的抑制作用，進(jìn)而阻止顆粒細(xì)胞凋亡和脫落。這些發(fā)現(xiàn)為研究“卵母細(xì)胞是否參與卵泡閉鎖的啟動(dòng)”指明了可能的途徑：即卵母細(xì)胞分泌功能障礙導(dǎo)致顆粒細(xì)胞無(wú)法解除Hx引起的增殖阻滯從而啟動(dòng)了卵泡閉鎖。

　　卵泡低氧微環(huán)境影響豬卵泡顆粒細(xì)胞增殖的關(guān)鍵機(jī)制被探明

 

　　卵巢卵泡生長(zhǎng)發(fā)育是母豬發(fā)情排卵的生理基礎(chǔ)。生長(zhǎng)中的卵泡具有兩種命運(yùn)：繼續(xù)發(fā)育與退化閉鎖，卵泡命運(yùn)決定機(jī)制一直是繁殖生物學(xué)領(lǐng)域需要解決的核心科學(xué)問(wèn)題。卵泡發(fā)育依賴于顆粒細(xì)胞的活躍增殖，顆粒細(xì)胞增殖活性顯然與卵泡命運(yùn)相關(guān)。然而，顆粒細(xì)胞增殖活性隨著卵泡發(fā)育逐漸減弱。那么，是什么原因?qū)е侣雅莅l(fā)育過(guò)程中顆粒細(xì)胞增殖潛力的逐步降低？

 

　　在哺乳動(dòng)物卵泡中，毛細(xì)血管分布于卵泡膜層，未能突破基膜進(jìn)入顆粒細(xì)胞層，導(dǎo)致顆粒細(xì)胞出現(xiàn)低氧狀態(tài)。隨著卵泡發(fā)育變大，顆粒細(xì)胞層與卵泡毛細(xì)血管的距離越來(lái)越遠(yuǎn)，導(dǎo)致顆粒細(xì)胞低氧程度不斷加劇。那么低氧是否與顆粒細(xì)胞增殖狀態(tài)有關(guān)？

 

　　本研究采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了數(shù)百個(gè)豬有腔卵泡顆粒細(xì)胞周期，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著卵泡直徑的增加，卵泡顆粒細(xì)胞G0/G1 期比例顯著升高。不僅如此，研究還發(fā)現(xiàn)，同樣大小的豬有腔卵泡其顆粒細(xì)胞G0/G1 期比例也存在較大差異。試驗(yàn)剝?nèi)×私?00 個(gè)直徑4 mm 左右的豬卵泡，分離的顆粒細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞周期檢測(cè)，根據(jù)G0/G1 的比例，分為G0/G1 比例高組和G0/G1 比例低組，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析。測(cè)序結(jié)果GO 分析發(fā)現(xiàn)，低氧應(yīng)答是調(diào)控顆粒細(xì)胞G0/G1 阻滯的主要生物學(xué)過(guò)程。利用體外低氧模型，進(jìn)一步證實(shí)低氧是誘導(dǎo)卵巢顆粒細(xì)胞G0/G1 阻滯，抑制顆粒細(xì)胞增殖的重要因素。

 

　　為明確低氧調(diào)控顆粒細(xì)胞周期的下游通路，課題組對(duì)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果進(jìn)行KEGG pathway 分析，發(fā)現(xiàn)在G0/G1 比例高組的顆粒細(xì)胞中顯著富集到FOXO 信號(hào)通路。進(jìn)一步研究揭示，在體內(nèi)外低氧條件下，G0/G1期顆粒細(xì)胞的比例升高伴隨著FOXO1核轉(zhuǎn)運(yùn)的增多，而敲降FOXO1后，可促進(jìn)顆粒細(xì)胞從G0/G1進(jìn)入S期。

 

　　根據(jù)測(cè)序結(jié)果，本研究從差異基因中找到了一個(gè)極顯著上調(diào)的候選基因TP53INP1。生物信息學(xué)分析顯示，TP53INP1 基因啟動(dòng)子區(qū)存在FOXO1 的結(jié)合位點(diǎn)。利用采用熒光素酶活性分析、染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）等技術(shù)，研究證實(shí)TP53INP1是FOXO1靶基因。同時(shí)，TP53INP1 與p53 存在復(fù)雜的相互調(diào)控，一方面TP53INP1 是p53 下游靶基因，另一方面，TP53INP1 能夠激活p53 活性，表現(xiàn)為對(duì)p53的正反饋調(diào)控。進(jìn)一步通過(guò)ChIP、RNAi等技術(shù)探索FOXO1/TP53INP1/p53軸的機(jī)制及功能，結(jié)果表明：在低氧環(huán)境中，顆粒細(xì)胞FOXO1入核直接上調(diào)了其靶基因TP53INP1表達(dá)，進(jìn)而激活p53，而p53作為調(diào)控CDKN1A表達(dá)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子上調(diào)了CDKN1A表達(dá)，最終CDKN1A發(fā)揮細(xì)胞周期抑制功能引起顆粒細(xì)胞增殖阻滯。

 

　　本研究首次從低氧角度解析卵泡顆粒細(xì)胞增殖調(diào)控機(jī)制，這將有助于明確卵泡命運(yùn)決定的本質(zhì)，并有可能為調(diào)控卵泡發(fā)育提供新的作用靶點(diǎn)，從而為提高家畜繁殖力以及人類不孕癥的臨床治療提供途徑。

 

　　論文一作為博士生李誠(chéng)瑜，通訊作者申明副研究員、劉紅林教授，劉昭君、吳剛、周佳奇、李偉建、劉爍等研究生也參與了上述研究。該研究得到了國(guó)家自然基金項(xiàng)目（31972564; 31972571; 31630072; 31601939）的資助。