近日，農(nóng)業(yè)微生物資源發(fā)掘與利用全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、湖北洪山實(shí)驗(yàn)室、華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物育種與健康養(yǎng)殖前沿科學(xué)中心晏向華教授團(tuán)隊(duì)研究成果以“Precise digital bacteria enumeration and antibiotic susceptibility testing via a portable vibrating capillary-based droplet platform”為題在Sensors and Actuators B: Chemical發(fā)表，研究開發(fā)了一種基于微流控液滴技術(shù)的數(shù)字化活細(xì)菌計(jì)數(shù)與抗生素敏感性測(cè)試新方法。同時(shí)研究人員還研制了一種豬血清中賴氨酸濃度的即時(shí)檢測(cè)裝置，相關(guān)研究成果以“Point-of-care testing for lysine concentration in swine serum via blue-emissive carbon dot-entrapped microfluidic chip”為題在Animal Nutrition發(fā)表。

 

　　抗生素耐藥性是人類健康的重大威脅，傳統(tǒng)的抗生素敏感性測(cè)試方法如肉湯稀釋法、紙片擴(kuò)散法等存在檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、樣品消耗量大等不足，無法有效滿足快速診斷的需求。研發(fā)快速、準(zhǔn)確、便攜的細(xì)菌抗生素敏感性測(cè)試方法與平臺(tái)，對(duì)于生豬健康養(yǎng)殖過程中規(guī)定的“飼料端無抗、養(yǎng)殖端減抗、產(chǎn)品端無抗”的抗生素含量和耐藥性細(xì)菌產(chǎn)生的即時(shí)檢測(cè)具有重要意義。

 

　　液滴數(shù)字化計(jì)數(shù)分析（droplet digital counting）是將原始樣本分散至大量等體積的納升級(jí)微液滴中，每個(gè)液滴作為一個(gè)獨(dú)立的生物反應(yīng)器，通過對(duì)包含待測(cè)目標(biāo)的液滴（陽(yáng)性液滴）進(jìn)行識(shí)別和計(jì)數(shù)，根據(jù)泊松分布可實(shí)現(xiàn)待測(cè)目標(biāo)的絕對(duì)定量。由于細(xì)菌被限制在納升級(jí)空間中生長(zhǎng)，有利于自身及代謝產(chǎn)物的富集，數(shù)字化細(xì)菌分析與抗生素敏感性測(cè)試可以大大縮短信號(hào)檢測(cè)所需的孵育時(shí)間。微流控芯片是目前最常用的數(shù)字化離散平臺(tái)，然而現(xiàn)有芯片的制作與操作對(duì)專業(yè)設(shè)備、技能及成本的要求較高，且微液滴的體積和數(shù)量難以靈活調(diào)節(jié)，限制了數(shù)字化分析的動(dòng)態(tài)范圍和精確度。

 

　　研究人員研發(fā)了一種聲波驅(qū)動(dòng)的可控微液滴生成技術(shù)與平臺(tái)，該平臺(tái)僅由一根由壓電膜片控制的玻璃毛細(xì)管、一個(gè)便攜式信號(hào)發(fā)生器和一個(gè)液滴收集池組成，裝置簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)便，且成本低廉。該液滴技術(shù)可高通量生成單分散微液滴，通過改變聲波信號(hào)參數(shù)，液滴體積從0.016 nL至26.4 nL連續(xù)、實(shí)時(shí)、靈活可調(diào)，可滿足多體積數(shù)字化細(xì)菌計(jì)數(shù)的需求。利用該技術(shù)，研究人員將活性指示劑刃天青與細(xì)菌共同包裹于兩種不同體積的微液滴中。細(xì)菌在液滴中繁殖會(huì)使指示劑反應(yīng)并產(chǎn)生紅色熒光；當(dāng)微液滴經(jīng)過孵育后，內(nèi)含活細(xì)菌的液滴可顯示熒光信號(hào)，而未包裹細(xì)菌或包裹死細(xì)菌的液滴則無明顯熒光信號(hào)。通過熒光成像，結(jié)合自主開發(fā)的圖像與數(shù)據(jù)處理程序，可快速實(shí)現(xiàn)陽(yáng)性和陰性液滴的識(shí)別與統(tǒng)計(jì)，并根據(jù)泊松分布，計(jì)算出樣本中的活細(xì)菌濃度。該方法可在5×10 2 CFU/mL至1×10 7 CFU/mL的范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)活細(xì)菌的快速、準(zhǔn)確計(jì)數(shù)；且與單體積液滴相比，多體積液滴分析極大提高了計(jì)數(shù)的動(dòng)態(tài)范圍和準(zhǔn)確性。

 

　　研究人員進(jìn)一步在液滴平臺(tái)上集成了一個(gè)3D打印旋轉(zhuǎn)進(jìn)樣切換裝置，通過中央切換閥的旋轉(zhuǎn)，可實(shí)現(xiàn)不同樣品的靈活切換與液滴生成，滿足不同濃度抗生素處理與檢測(cè)的需求。將細(xì)菌、抗生素和指示劑共同包裹于液滴中，通過計(jì)算不同濃度抗生素處理下樣品中細(xì)菌的存活率，擬合得到抗生素濃度與細(xì)菌存活率的關(guān)系曲線，可以準(zhǔn)確評(píng)估抗生素的最小抑菌濃度。該方法可將抗生素敏感性測(cè)試時(shí)間由傳統(tǒng)方法的20小時(shí)以上縮短至5小時(shí)，且通過微液滴體積的靈活調(diào)節(jié)可實(shí)現(xiàn)單個(gè)液滴中細(xì)菌濃度的精確設(shè)置，準(zhǔn)確評(píng)估細(xì)菌初始接種濃度對(duì)抗生素敏感性測(cè)試結(jié)果的影響。

 

　　華中農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院丁馳竹副教授、碩士研究生劉越為共同第一作者，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)科動(dòng)醫(yī)學(xué)院何子怡副研究員、晏向華教授為共同通訊作者。該研究受到了國(guó)家自然科學(xué)基金、華中農(nóng)業(yè)大學(xué)自主科技創(chuàng)新基金和農(nóng)業(yè)微生物重大基礎(chǔ)設(shè)施項(xiàng)目的資助。

 

　　賴氨酸是生長(zhǎng)豬必需氨基酸之一，也是玉米-豆粕型日糧的第一限制性氨基酸。在我國(guó)豆粕減量替代方案和低蛋白日糧技術(shù)推廣過程中，賴氨酸若缺乏會(huì)限制豬生長(zhǎng)性能發(fā)揮，但過量補(bǔ)充賴氨酸不僅會(huì)造成浪費(fèi)，還會(huì)影響精氨酸、組氨酸等其他氨基酸的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)。由于賴氨酸缺乏或過量都有負(fù)面影響，而賴氨酸需求量是一個(gè)涉及多種因素的動(dòng)態(tài)變化量，因此需要一種簡(jiǎn)單有效的賴氨酸營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)評(píng)定方法。血液中賴氨酸濃度是賴氨酸營(yíng)養(yǎng)狀況的直接反映，但現(xiàn)有的檢測(cè)方法依賴于氨基酸自動(dòng)化分析儀，不能滿足現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的要求。

 

　　研究人員首先研發(fā)了一種氮摻雜碳點(diǎn)作為檢測(cè)賴氨酸的熒光探針，該探針在紫外激發(fā)下能發(fā)出藍(lán)色熒光，且熒光強(qiáng)度隨賴氨酸濃度增加而增強(qiáng)，具有高的熒光量子產(chǎn)率、穩(wěn)定性、靈敏度和特異性。接下來，研究人員將該氮摻雜碳點(diǎn)包裹在水凝膠微結(jié)構(gòu)中，作為核心檢測(cè)元件，設(shè)計(jì)了用于快速測(cè)定賴氨酸濃度的微流控芯片，將一次檢測(cè)所需的血清樣本量降至3 μL。試驗(yàn)結(jié)果表明，利用熒光顯微鏡對(duì)該芯片拍照，根據(jù)熒光強(qiáng)度變化可以準(zhǔn)確測(cè)量賴氨酸濃度。

 

　　最后，研究人員設(shè)計(jì)制作了一個(gè)成像附件，以提供穩(wěn)定的激發(fā)光和拍照環(huán)境，將微流控芯片和智能手機(jī)集成為便攜式的即時(shí)檢測(cè)平臺(tái)，通過用智能手機(jī)對(duì)微流控芯片拍照實(shí)現(xiàn)測(cè)量。該平臺(tái)只需3 μL豬血清樣品，檢出限小于16 μmol/L，滿足豬血清中賴氨酸濃度的正常范圍，檢測(cè)時(shí)間約3分鐘；具有操作簡(jiǎn)單、反應(yīng)迅速、成本低、采血量小、減輕豬應(yīng)激等優(yōu)點(diǎn)，可用于豬賴氨酸營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，為我國(guó)豆粕減量替代方案和低蛋白日糧技術(shù)策略下的精確飼料配方提供依據(jù)。

 

　　華中農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院丁馳竹副教授為第一作者，動(dòng)科動(dòng)醫(yī)學(xué)院晏向華教授為通訊作者。該研究受到了國(guó)家自然科學(xué)基金的資助。

 

　　【論文1英文摘要】Antibiotic resistance can lead to multidrug-resistant superbugs and threaten global health, putting forward a high demand for accurate and fast antibiotic susceptibility testing （AST）。 Conventional AST methods are labor-intensive and time-consuming, far from meeting the requirement for rapid clinical decision-making. Here, we develop a portable vibrating capillary-based droplet platform for precise digital bacteria enumeration and rapid AST. Multi-volume droplets encapsulating bacteria with or without antibiotics are generated on demand, and the elevated fluorescence from resazurin reduction is measured, which corresponds to the growing bacteria. Automated data analysis is achieved by a self-developed image processing program. Multi-volume droplet digital counting allows precise bacteria enumeration over a wide dynamic range spanning more than 4 orders of magnitude. Droplet digital AST of ampicillin against E. coli demonstrates that it is feasible for accurately assessing the minimum inhibitory concentration and investigating the inoculum effect, with the assay time reduced to 5 hr. In sum, this method is easy to operate, cost-effective, with high accuracy and short time-to-result, which is highly promising for rapid and precise assessment of antimicrobial susceptibility in resource-limited settings.

 

　　論文1鏈接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0925400522018974

 

　　【論文2英文摘要】Lysine is one of the essential amino acids and plays a vital role in the growth, development and health of pigs. Blood lysine concentration is a direct indication of lysine status; however, current methods can not satisfy the demands for rapid and on-site lysine concentration measurement of swine serum. Here, we developed blue-emissive nitrogen-doped carbon dots as a fluorescence probe for the determination of lysine with high fluorescence quantum yield, stability, sensitivity and specificity. The carbon dots were entrapped within hydrogel microstructures to fabricate microfluidic chips for rapid assay for lysine quantification. We further developed an imaging attachment to integrate the microfluidic chip and a smartphone into a portable point-of-care testing platform. This platform requires only 3 μL sample and has a linear detection range of 25 to 300 μmol/L with a limit of detection less than 16 μmol/L, which covers the normal range of lysine concentration in swine serum. We tested lysine concentration in swine serum using this platform with high accuracy, low sample consumption, and within 3 min. Together, these results may provide a rapid and portable platform for dynamic monitoring of swine lysine status and contribute to precise feed formula modulation with low-protein diet strategy.

 

　　論文2鏈接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2405654522001433