6月8日，華中農業(yè)大學(xué)張椿雨教授團隊聯(lián)合華中科技大學(xué)栗茂騰教授團隊在生物學(xué)期刊Genome Research上發(fā)表了題為Genome-scale targeted mutagenesis in Brassica napus using a pooled CRISPR library的研究論文。該研究通過(guò)混合的CRISPR文庫在甘藍型油菜中構建了高通量的靶向敲除突變體庫并評估了靶點(diǎn)的編輯效率。本突變體庫是利用CRISPR-Cas9基因編輯系統在甘藍型油菜中構建的第一個(gè)高通量靶向敲除突變體庫，并通過(guò)正、反向遺傳學(xué)篩選，獲得了系列影響含油量等重要農藝性狀的新基因。

 

　　CRISPR-Cas9是近年來(lái)興起的基因組編輯工具，已被應用在水稻、玉米和擬南芥等二倍體植物中構建靶向敲除突變體庫，但應用到四倍體作物中還鮮有報道。異源四倍體甘藍型油菜（Brassica napus, AACC, 2n=38）是我國第一大油料作物，利用CRISPR-Cas9對其復雜基因組進(jìn)行高通量靶向突變，將為具優(yōu)異性狀的新種質(zhì)的高通量創(chuàng )建、重要新基因的批量挖掘、乃至油菜分子設計育種奠定堅實(shí)基礎。

 

　　在本文中，作者首先設計了18414個(gè)sgRNA以用于靶向10480個(gè)與油菜生殖器官發(fā)育和種子形成等相關(guān)基因。將該混合的CRISPR-Cas9表達文庫遺傳轉化甘藍型油菜獲得1104個(gè)轉基因再生株系。測序分析結果表明，所檢測的178個(gè)靶基因里有93個(gè)發(fā)生了靶點(diǎn)編輯，即評估的靶點(diǎn)編輯效率為52.2%。研究發(fā)現，當sgRNA同時(shí)靶向多個(gè)油菜基因同源拷貝時(shí)，Cas9蛋白傾向于切割所有的拷貝從而實(shí)現靶位點(diǎn)的編輯。同時(shí)，作者利用已檢測過(guò)靶點(diǎn)編輯情況的轉基因株系對多種重要表型進(jìn)行了反向遺傳學(xué)篩選，驗證了該突變體庫高通量篩選特征及部分基因的功能；并進(jìn)一步通過(guò)正向遺傳學(xué)篩選挖掘到系列控制種子含油量或脂肪酸組分等重要農藝性狀的新基因，這些基因的編輯可明顯改變種子的含油量或脂肪酸組分。

 

　　該工作為甘藍型油菜基因功能的高通量研究提供了寶貴種質(zhì)資源，所發(fā)掘的系列調控含油量等重要農藝性狀的新基因，為油菜重要農藝性狀的分子改良提供了有價(jià)值的基因資源。同時(shí)，該研究也為其它多倍體植物開(kāi)展高通量的靶向突變提供了一個(gè)有益的借鑒。

 

　　華中農業(yè)大學(xué)張椿雨教授和華中科技大學(xué)栗茂騰教授為論文共同通訊作者，博士生何堅杰及張凱博士為共同第一作者，博士生閆書(shū)祥、碩士生唐蜜和周惟賢、尹永泰博士和陳康博士也參與了此項研究。本研究得到國家重點(diǎn)研發(fā)計劃“油菜和花生重要基因資源挖掘與利用”（2022YFD1200402）和國家自然科學(xué)基金面上項目 （32272067和32072098） 的資助。

 

　　論文鏈接：

 

　　https://genome.cshlp.org/content/early/2023/05/30/gr.277650.123.full.pdf+html