各位親,那乳糖發(fā)酵試驗與ONPG試驗,你有木有傻傻地分不清?還是聽額細細道來哈。
先說乳糖發(fā)酵試驗,這是用來檢測細菌分解乳糖能力的一種生化試驗。大家知道,乳糖是葡萄糖和半乳糖這兩個單糖,通過糖苷鍵連接而成一種雙糖。而乳糖的分解呢,是乳糖在β-半乳糖苷酶的作用下,糖苷鍵發(fā)生斷裂并產(chǎn)生葡萄糖和半乳糖。
這β-半乳糖苷酶是在細胞內(nèi)的咧,其實細菌分解乳糖,一般還需要一種位于細胞膜上的β-半乳糖苷滲透酶來參與。這β-半乳糖苷滲透酶的作用嘛,是將細胞外的乳糖分子主動轉(zhuǎn)運到細胞內(nèi)。所以說啊,乳糖發(fā)酵試驗可以檢測兩種酶:β-半乳糖苷酶和β-半乳糖苷滲透酶。
具有這兩種酶的細菌,可迅速將乳糖分子主動轉(zhuǎn)運到細跑內(nèi),在24小時內(nèi)即可分解乳糖并產(chǎn)酸,導(dǎo)致乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基的顏色發(fā)生變化,表現(xiàn)為乳糖發(fā)酵試驗陽性。而缺乏此兩種酶的細菌,因為不能分解乳糖產(chǎn)酸,乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基不會變色,乳糖發(fā)酵試驗呈現(xiàn)為陰性。還有一些乳糖遲緩發(fā)酵的細菌,只具備β-半乳糖苷酶,但是由于缺乏β-半乳糖苷滲透酶,乳糖只能通過被動擴散緩慢地進入細胞內(nèi),培養(yǎng)3天以上,才能使乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基變色,表現(xiàn)為乳糖遲緩發(fā)酵。
至于ONPG試驗咧,是用于快速檢測β-半乳糖苷酶的一種生化試驗。與乳糖不同,鄰硝基酚-β-D-半乳糖苷(ONPG)可迅速進入細菌細胞內(nèi),ONPG被β-半乳糖苷酶水解后,釋放出黃色的鄰硝基酚(ONP),培養(yǎng)基因此變黃,ONPG試驗表現(xiàn)為陽性。細菌若沒有β-半乳糖苷酶,就不分解進入細胞的ONPG,不能釋放出黃色的ONP,ONPG試驗結(jié)果也就為陰性。
總而言之,不同的細菌具有不同的酶,乳糖發(fā)酵與ONPG試驗可有以下四種結(jié)果。
甲、乳糖發(fā)酵試驗陽性,ONPG試驗陽性: 對于大多數(shù)大腸埃希氏菌,由于同時具有β-半乳糖苷滲透酶和β-半乳糖苷酶,其表現(xiàn)為發(fā)酵乳糖,ONPG試驗也為陽性。
乙、乳糖發(fā)酵試驗陰性,ONPG試驗陰性: 對于普通變形桿菌,β-半乳糖苷滲透酶和β-半乳糖苷酶都木有,其表現(xiàn)為不發(fā)酵乳糖,ONPG試驗為陰性。
丙、乳糖發(fā)酵遲緩陽性,ONPG試驗陽性:對于亞利桑那菌,雖然具有β-半乳糖苷酶,但缺少β-半乳糖苷滲透酶,其表現(xiàn)為乳糖遲緩發(fā)酵,ONPG試驗還是陽性滴。
丁、乳糖發(fā)酵試驗陽性,ONPG試驗陰性:有些不動桿菌和假單胞菌,β-半乳糖苷滲透酶和β-半乳糖苷酶也都是木有,雖然不能分解乳糖,但是卻可將乳糖轉(zhuǎn)化為乳糖酸,也能導(dǎo)致乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基變色,表現(xiàn)為發(fā)酵乳糖的假象,由于缺乏β-半乳糖苷酶,其ONPG試驗卻是陰性滴。
親,這乳糖發(fā)酵試驗與ONPG試驗,你都能分清了吧 ?是不是美滴很,美滴很?不要著急,還有一個贈品呢:下面再說說ONPG試驗的注意事項。
1、良好的緩沖作用是ONPG試驗的關(guān)鍵,所以說接種前最好將那ONPG溶液,在36℃水浴一段時間,以溶解在儲存過程中產(chǎn)生的磷酸鹽結(jié)晶。
2、細菌的接種量要大些哈,這樣既可加快反應(yīng)速度,也有利于結(jié)果觀察。
3、ONPG試劑一般情況下是無色的,但有時其中的蛋白胨可致試劑呈輕微黃色,此時應(yīng)加做陰性對照予以區(qū)分。
4、需要提醒的是,ONPG試驗不能用于產(chǎn)黃色素細菌的檢測,如果懷疑培養(yǎng)基變黃是細菌產(chǎn)黃色素的緣故,要先離心再來進行結(jié)果判讀。
5、葡萄糖對β-半乳糖苷酶有抑制作用,在含乳糖的培養(yǎng)基上生長的細菌,其β-半乳糖苷酶活性也就更高。總之,用乳糖含量高的培養(yǎng)基,就對咧!
主要參考文獻:
1、J F MacFadden. Biochemical Tests for Identification of Medical Bacteria[M]. Third Edition. Williams & Wilkins, Baltimore, 2000.
2、Lapage S P, Efstratiou A, Hill L R. The ortho-nitrophenol (ONPG) test and acid from lactose in Gram-negative genera[J]. Journal of Clinical Pathology, 1973, 26(11):821-825.