近日，免疫所禽用疫苗抗原創(chuàng)制創(chuàng)新團(tuán)隊在酵母表達(dá)納米抗體方面取得重要進(jìn)展，研究成果以題為“AUniversal Strategy for the Efficient expression of Nanobodies inPichia pastoris”發(fā)表于《Fermentation》雜志。

 

　　在駱駝科和鯊魚科動物的血清中天然存在輕鏈缺失的抗體，其重鏈的可變區(qū)是已知有效結(jié)合完整抗原片段的最小單元，因此被稱為納米抗體。近年來，納米抗體在疾病治療、成像診斷、病毒中和以及ELISA檢測等方面發(fā)揮著關(guān)鍵性作用。畢赤酵母無內(nèi)毒素風(fēng)險，具有較強(qiáng)的分泌表達(dá)能力，能夠以低廉的成本進(jìn)行高密度發(fā)酵，因此是表達(dá)納米抗體的理想宿主。畢赤酵母生產(chǎn)的多種納米抗體藥物如ALX-0061、ALX-0171、Everestmab等已進(jìn)入臨床階段。本研究利用Va、Vb和Vc三種納米抗體作為模式蛋白，探索通用型納米抗體高效表達(dá)技術(shù)。

 

　　首先，通過改變lox71的位置構(gòu)建出能夠?qū)崿F(xiàn)雙抗性基因敲除的親本質(zhì)粒pLD。啟動子和信號肽的優(yōu)化使Va產(chǎn)量分別增加1.38倍和1.89倍。優(yōu)化基因劑量可使Va產(chǎn)量提高1.39倍。在野生型AOX1啟動子的控制下25種分子伴侶蛋白與Va共表達(dá)，其中HAC1使Va產(chǎn)量提高1.5倍。在此基礎(chǔ)上使用弱化的AOX1啟動子突變體55p對HAC1的表達(dá)強(qiáng)度進(jìn)行微調(diào)，Va產(chǎn)量進(jìn)一步增加2.41倍。最后通過高密度發(fā)酵Va產(chǎn)量達(dá)到2.13g/L，與初始菌株1-AOXα-Va的搖瓶表達(dá)產(chǎn)量相比提高49.8倍。將pLD-55p-HAC1質(zhì)粒整合到GS115基因組中形成預(yù)整合HAC1分子伴侶的H55宿主，將多拷貝質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到該宿主后Vb和Vc產(chǎn)量分別增加1.98倍和2.34倍。無抗生素親本質(zhì)粒的工程設(shè)計、表達(dá)元件的修飾、基因劑量的優(yōu)化以及H55宿主被組合成一種復(fù)合策略，為未來納米抗體的高效酵母表達(dá)鋪平道路。

 

　　無抗化畢赤酵母表達(dá)平臺是禽用疫苗抗原創(chuàng)制創(chuàng)新團(tuán)隊的核心表達(dá)平臺之一，基于該平臺多種酶制劑的產(chǎn)量已達(dá)到10g/L以上水平。重組人膠原蛋白、塑料降解酶、KEX2、腸激酶、犬α干擾素、貓犬白蛋白及CSFVE2抗原、PCV3Cap抗原等重組蛋白亦借助該平臺實現(xiàn)高效表達(dá)。

 

　　碩士研究生鄭毅恒為論文第一作者，免疫所禽用疫苗抗原創(chuàng)制創(chuàng)新團(tuán)隊李丁副研究員為論文通訊作者。該研究得到國家自然科學(xué)基金（32002316、31961133017）的資助。

 

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