本網(wǎng)訊 近日，中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院生態(tài)與功能農(nóng)業(yè)課題組郭巖彬副教授在生態(tài)環(huán)境科學(xué)和工程領(lǐng)域Top期刊《Journal of Hazardous Materials》上發(fā)表題為“Highly stable selenium nanoparticles: Assembly and stabilization via flagellin FliC and porin OmpF in Rahnella aquatilis HX2”的文章。

 

　　硒是人和動(dòng)物必需的微量礦質(zhì)元素，但其有益到有害的濃度范圍較窄，成為制約硒營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化等應(yīng)用的關(guān)鍵問題。納米粒徑的單質(zhì)硒（納米硒）因具有活性強(qiáng)、毒性低等特點(diǎn)使其成為解決硒應(yīng)用濃度范圍窄的最佳硒形態(tài)，同時(shí)納米硒在生物體內(nèi)表現(xiàn)出抗氧化、抗菌、抗病毒、抗腫瘤等多重生物活性而備受國(guó)內(nèi)外關(guān)注。納米硒可以通過化學(xué)還原方法獲得（化學(xué)納米硒），也可以通過微生物（細(xì)菌等）生物合成途徑獲得（生物納米硒）。與化學(xué)納米硒相比，細(xì)菌合成的生物納米硒具有穩(wěn)定性高、活性強(qiáng)、生物轉(zhuǎn)化效率高、環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)小等優(yōu)勢(shì)，使其成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。但國(guó)內(nèi)外關(guān)于生物納米硒在細(xì)菌體內(nèi)如何組裝以及其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定機(jī)制還缺乏系統(tǒng)性研究。該研究揭示了細(xì)菌生物合成納米硒在體內(nèi)的組裝控制及維持其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的機(jī)制。

 

　　課題組利用生物納米硒高效合成菌株Rahnella aquatilis HX2發(fā)酵合成生物納米硒，并將其進(jìn)行了分離和純化，獲得的生物納米硒與化學(xué)納米硒相比，在酸、堿、陽(yáng)離子、氧化劑和高低溫等條件下具有顯著性的穩(wěn)定性。為解析細(xì)菌合成的生物納米硒高穩(wěn)定性機(jī)制，從純化的生物納米硒上剝離獲得兩種蛋白，分別為鞭毛蛋白FliC 和孔蛋白OmpF。在R. aquatilis HX2菌體內(nèi)通過基因缺失突變，獲得fliC 和ompF單基因突變體，或fliC 和ompF雙基因突變體，無論單基因突變還是共同突變，都不影響生物納米硒在細(xì)菌中的合成量，但影響生物納米硒在細(xì)菌中的組裝，在突變體中生物納米硒球形組裝能力喪失，生物納米硒由球形變成了不規(guī)則形。在突變體中遺傳互補(bǔ)fliC 和ompF基因后，生物納米硒的組裝得到恢復(fù)，恢復(fù)成球形納米硒，從而揭示了生物納米硒在細(xì)菌體內(nèi)維持球形結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性機(jī)理。

 

　　為驗(yàn)證鞭毛蛋白FliC 和孔蛋白OmpF是否具有體外組裝功能，將HX2菌株的鞭毛蛋白FliC-HX2 和孔蛋白OmpF-HX2和大腸桿菌K12菌株中的鞭毛蛋白FliC-K12 和孔蛋白OmpF-K12分別進(jìn)行了外源表達(dá)和純化。利用外源表達(dá)蛋白在體外進(jìn)行納米硒組裝，結(jié)果表明FliC-HX2、OmpF-HX2、FliC-K12 和OmpF-K12都可以在體外實(shí)現(xiàn)納米硒的組裝，其中來源于HX2菌株的FliC-HX2和OmpF-HX2蛋白組裝的納米硒比大腸桿菌的FliC-K12 和OmpF-K12組裝的納米硒粒徑小。從體外組裝的納米硒上剝離蛋白，并利用抗體對(duì)剝離的蛋白進(jìn)行Western blot檢測(cè)，驗(yàn)證了納米硒體外組裝由這四個(gè)蛋白分別控制。研究結(jié)果說明鞭毛蛋白FliC 和孔蛋白OmpF在無論是細(xì)菌體內(nèi)還是在體外都可以控制納米硒的組裝。

 

　　為進(jìn)一步分析驗(yàn)證鞭毛蛋白FliC 和孔蛋白OmpF在生物納米硒結(jié)構(gòu)穩(wěn)定中的作用，利用外源表達(dá)的FliC-HX2和OmpF-HX2對(duì)化學(xué)納米硒進(jìn)行表面修飾，在強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、高離子濃度條件下分析修飾后的化學(xué)納米硒的穩(wěn)定性，并以納米材料常用的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定劑SDS、PEG、BSA、PVP，以及大腸桿菌的FliC-K12 和OmpF-K12作為對(duì)照，SDS和PEG在強(qiáng)酸堿等測(cè)試條件下無法穩(wěn)定化學(xué)納米硒的結(jié)構(gòu)，BSA、PVP、FliC-K12 和OmpF-K12在不同程度上均可以提高化學(xué)納米硒的穩(wěn)定性，水生拉恩氏菌FilC-HX2和OmpF-HX2的穩(wěn)定效能是PVP、BSA以及大腸桿菌FilC和OmpF的10-100倍。研究結(jié)果表明，水生拉恩氏菌HX2的鞭毛蛋白FliC 和孔蛋白OmpF對(duì)維持生物納米硒的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定具有極其重要的作用，并能夠在體外顯著提高化學(xué)納米硒的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，該研究同時(shí)也發(fā)現(xiàn)水生拉恩氏菌HX2的鞭毛蛋白FliC 和孔蛋白OmpF對(duì)維持納米硒的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定能力具有特異性。該研究為納米硒在農(nóng)業(yè)（種植、養(yǎng)殖等）以及生物醫(yī)藥等領(lǐng)域的應(yīng)用提供了理論與技術(shù)支持。

 

　　據(jù)悉，近年來課題組共篩選獲得高效合成生物納米硒的細(xì)菌菌株近1000株，并完成了生物納米硒工廠化發(fā)酵工藝和分離純化工藝，建立了生物納米硒規(guī)模化生產(chǎn)技術(shù)。同時(shí)完成了納米硒在小麥、水稻、食用菌等作物的吸收轉(zhuǎn)化機(jī)理以及近30多種作物的富硒生產(chǎn)技術(shù)，相關(guān)研究成果先后在LWT - Food Science and Technology，F(xiàn)rontiers in Plant Science，Journal of Nanobiotechnology等期刊發(fā)表。相關(guān)技術(shù)成果在黑龍江、江西、湖南、重慶、河北、山西等十多個(gè)省市的小麥、水稻、大豆、小米等近20種作物示范推廣10多萬畝，取得了顯著經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。本研究?jī)?nèi)容已申請(qǐng)國(guó)家發(fā)明專利“提高納米材料穩(wěn)定性的方法（2021101035703和2021101052624）”，課題組已獲授權(quán)生物納米硒國(guó)家發(fā)明專利6項(xiàng)，化學(xué)納米硒國(guó)家發(fā)明專利1項(xiàng)，其中“利用地衣芽孢桿菌生物合成納米硒的方法及其應(yīng)用（ZL201610946282.3）”已經(jīng)完成成果轉(zhuǎn)化，并被北京市知識(shí)產(chǎn)權(quán)局評(píng)選為“2018年度專利商用化優(yōu)秀項(xiàng)目”。

 

　　博士生李奎為論文第一作者，郭巖彬副教授為論文的通訊作者。論文得到國(guó)家自然科學(xué)基金（項(xiàng)目編號(hào)：31470531）和國(guó)家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)“優(yōu)質(zhì)高效富硒農(nóng)產(chǎn)品關(guān)鍵技術(shù)研究與示范”（項(xiàng)目編號(hào)：201303106）項(xiàng)目資助。

 

　　論文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.jhazmat.2021.125545